豬流行性腹瀉(PED)是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的一種急性、高度接觸性腸道傳染病。該病主要危害哺乳仔豬,5日齡內(nèi)的仔豬感染后死亡率可達(dá)100%。目前該病主要的防治方法是疫苗免疫,但是自2010年P(guān)ED在中國再次暴發(fā)以來,疫苗免疫效果不佳,無法給豬群提供保護(hù),給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大損失。已有的研究發(fā)現(xiàn)PEDV變異是疫苗失效的主要原因,因此研究地方毒株的組織培養(yǎng)特性及遺傳進(jìn)化具有重要意義。本研究采集河北省規(guī)模養(yǎng)豬場腹瀉仔豬的小腸及腸內(nèi)容物,經(jīng)RT-PCR檢測(cè),將陽性病料過濾處理后,接種于Vero細(xì)胞盲傳,結(jié)果直至第5代出現(xiàn)典型病變;進(jìn)一步經(jīng)RT-PCR檢測(cè)、間接免疫熒光試驗(yàn)和透射電鏡觀察后,最終證實(shí)成功分離到PEDV,將其命名為HBQHD1株。參照PEDV AJ1102株的全基因序列,設(shè)計(jì)16對(duì)引物,對(duì)HBQHD1株全基因組進(jìn)行測(cè)定。提取HBQHD1株的RNA模板,經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后,得到16個(gè)片段目的基因,經(jīng)克隆、測(cè)序、拼接后,得到HBQHD1株的全基因序列,并將其提交至NCBI,GenBank登陸號(hào)為MK606368.1。HBQHD1株基因組全長28038bp,經(jīng)與25株具有...

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
縮略詞
摘要
ABSTRACT
第一章 緒論
    1.1 豬流行性腹瀉病毒
        1.1.1 PEDV的理化特性
        1.1.2 PEDV的培養(yǎng)特性
        1.1.3 PEDV的基因結(jié)構(gòu)
        1.1.4 編碼的蛋白結(jié)構(gòu)及功能
    1.2 PED的流行病學(xué)
    1.3 PED的病理變化和臨床癥狀
    1.4 PED的診斷技術(shù)
        1.4.1 中和試驗(yàn)
        1.4.2 免疫熒光法
        1.4.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)
        1.4.4 膠體金免疫層析法
    1.5 PEDV疫苗的研究
        1.5.1 滅活疫苗
        1.5.2 弱毒疫苗
        1.5.3 核酸疫苗
        1.5.4 轉(zhuǎn)基因植物疫苗
        1.5.5 基因工程疫苗
        1.5.6 亞單位疫苗
    1.6 防治
    1.7 研究的目的與意義
第二章 河北省PEDV流行株的分離鑒定
    2.1 試驗(yàn)材料
        2.1.1 病料
        2.1.2 細(xì)胞及毒株
        2.1.3 主要試劑耗材
        2.1.4 主要儀器
        2.1.5 試劑配制
        2.1.6 引物設(shè)計(jì)與合成
    2.2 試驗(yàn)步驟
        2.2.1 病料的采集與處理
        2.2.2 RNA的提取
        2.2.3 RT-PCR檢測(cè)
        2.2.4 胰酶濃度測(cè)定
        2.2.5 PEDV在 Vero細(xì)胞上增殖
        2.2.6 PEDV分離株間接免疫熒光(IFA)鑒定
        2.2.7 病毒粒子透射電鏡觀察
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 RT-PCR檢測(cè)
        2.3.2 最佳胰酶濃度測(cè)定
        2.3.3 病毒的分離和傳代
        2.3.4 間接免疫熒光試驗(yàn)
        2.3.5 病毒形態(tài)的電鏡觀察
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第三章 全基因組序列的測(cè)定與遺傳進(jìn)化分析
    3.1 試驗(yàn)材料
        3.1.1 毒株、菌種及載體
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 主要儀器
        3.1.4 試劑配制
        3.1.5 引物設(shè)計(jì)與合成
    3.2 試驗(yàn)方法
        3.2.1 病毒處理
        3.2.2 RNA提取
        3.2.3 RT-PCR
        3.2.4 PEDV全基因組擴(kuò)增
        3.2.5 PCR產(chǎn)物純化
        3.2.6 DNA連接轉(zhuǎn)化
        3.2.7 重組質(zhì)粒鑒定
        3.2.8 序列測(cè)定與拼接
        3.2.9 全基因組序列分析
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 全基因擴(kuò)增結(jié)果
        3.3.2 全基因片段克隆及拼接
        3.3.3 HBQHD1株基因組結(jié)構(gòu)分析
        3.3.4 HBQHD1株S蛋白的遺傳進(jìn)化分析
        3.3.5 HBQHD1株M蛋白的遺傳進(jìn)化分析
        3.3.6 HBQHD1株N蛋白的遺傳進(jìn)化分析
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第四章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
參加科研情況說明
致謝



本文編號(hào)：3736712