卵黃抗體不僅可以對特定的病原起到很好的防控效果,同時由于卵黃抗體自身含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)可以作為飼料添加劑提高動物的生長性能。因此,通過抗體蛋白飼料添加劑途徑控制某些病毒性疾病不失為一種解決方法。豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea, PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）引起的一種以嘔吐、腹瀉和脫水為主要臨床特征的高度接觸性、高度致死性的傳染病,是仔豬健康的主要威脅,而常規(guī)的疫苗免疫母豬對仔豬的保護效果不佳。因此,研發(fā)抗豬腹瀉的卵黃抗體飼料添加劑便成為新的研究熱點之一。本研究從患有豬流行性腹瀉仔豬腸道組織中克隆了豬流行性腹瀉病毒S基因中抗原指數(shù)較高且含有中和抗原域的499～638aa（COE基因）和636-789aa（PEDVS534基因）兩段基因。利用基因重組技術(shù)將COE和PEDVS534兩個中和抗原表位區(qū)克隆至載體pMD18-T上,酶切后連接pET-32a表達載體在大腸桿菌中表達。將原核表達的CC、PEDVS534兩種重組蛋白和豬流行性腹瀉全病毒滅活苗分別用白油佐劑乳化,分組免疫9月齡海... 

【文章頁數(shù)】：56 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
文獻綜述
    1 卵黃抗體概述
        1.1 IgY的結(jié)構(gòu)
        1.2 卵黃抗體的性質(zhì)及特點
            1.2.1 產(chǎn)量高
            1.2.3 性能穩(wěn)定
            1.2.4 治療效果好,安全性高
        1.3 卵黃抗體的應(yīng)用
            1.3.1 卵黃抗體在診斷方面的應(yīng)用
            1.3.2 卵黃抗體在防治疾病方面的應(yīng)用
    2 卵黃抗體飼料添加劑的研究進展
    3 豬流行性腹瀉概述
        3.1 PEDV的病原學(xué)特征
        3.2 PED的流行病學(xué)特征
        3.3 PED臨床癥狀和病理變化
        3.4 PEDV基因組結(jié)構(gòu)
            3.4.1 豬流行性腹瀉病毒的基因組成
            3.4.2 S蛋白的功能特性
            3.4.3 M蛋白的功能特性
            3.4.4 N蛋白的功能特性
        3.5 豬流行性腹瀉的診斷與防治
            3.5.1 豬流行性腹瀉的診斷
            3.5.2 豬流行性腹瀉的防治
    4 不同形式免疫原制備抗PEDV卵黃抗體
        4.1 PEDV全病毒免疫原制備卵黃抗體
        4.2 重組蛋白抗原制備卵黃抗體
    5 PEDV的中和抗原表位研究
    6 病毒蛋白基因的原核表達與真核表達
        6.1 原核表達
        6.2 真核表達系統(tǒng)
        6.3 畢赤酵母表達系統(tǒng)的應(yīng)用
1 引言
2 材料與方法
    2.1 試驗材料
        2.1.1 毒株、菌株、質(zhì)粒、細胞及實驗動物
        2.1.2 PCR擴增引物設(shè)計
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 主要試劑
    2.2 實驗方法
        2.2.1 豬流行性腹瀉病毒PEDVS_(534)和PEDVS COE基因的克隆及原核表達
            2.2.1.1 PEDVS_(534)和PEDVS COE基因的擴增
            2.2.1.2 PEDVS_(534)和COE基因的克隆
            2.2.1.3 PEDVS_(534)和COE基因的表達
            2.2.1.4 目的蛋白的純化
            2.2.1.5 表達蛋白的免疫原性分析
        2.2.2 PEDV COE基因的畢赤酵母表達
            2.2.2.1 COE基因畢赤酵母表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化
            2.2.2.2 重組酵母菌株的鑒定
            2.2.2.3 重組酵母菌株的誘導(dǎo)表達
            2.2.2.4 重組蛋白的Western blot鑒定
            2.2.2.5 重組蛋白免疫小鼠及血清中和試驗的測定
        2.2.3 卵黃抗體的制備
            2.2.3.1 免疫原的制備
            2.2.3.2 免疫程序
            2.2.3.3 卵黃抗體的提取
            2.2.3.4 卵黃抗體中和效價的測定
        2.2.4 卵黃抗體的臨床試驗
3 結(jié)果與分析
    3.1 PEDVS534和PEDVS COE基因的克隆及原核表達
        3.1.1 PEDVS534和PEDVS COE基因的克隆
        3.1.2 pMD18-T-PEDVS_(534)和pMD18-T-COE酶切鑒定
        3.1.3 PEDVS_(534)和COE基因重組表達質(zhì)粒的PCR及雙酶切鑒定
        3.1.4 PEDVS_(534)及COE重組蛋白的表達及Western blot
    3.2 COE基因畢赤酵母表達
        3.2.1 畢赤酵母表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.2.2 pPIC9K-COE重組酵母菌株的篩選與鑒定
        3.2.3 COE重組酵母菌株分泌表達蛋白的SDS-PAGE及Western blot
        3.2.4 病毒中和試驗
    3.3 卵黃抗體純化效果
        3.3.1 卵黃抗體的純化效果
        3.3.2 卵黃抗體的Western blot
    3.4 卵黃抗體的效價檢測
        3.4.1 卵黃抗體的效價測定
        3.4.2 卵黃抗體的臨床試驗
            3.4.2.1 發(fā)病豬病料臨床檢測
            3.4.2.2 發(fā)病豬場臨床試驗
4 討論
    4.1 COE基因的畢赤酵母表達研究
    4.2 不同免疫原制備的卵黃抗體中和效力比較
5 結(jié)論
參考文獻
致謝
作者簡介
在讀期間論文發(fā)表情況


【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：3732675