干擾素-γ（IFN-γ）誘導(dǎo)的先天性免疫應(yīng)答在抑制弓形蟲感染中起著重要的作用。IFN-γ介導(dǎo)的小鼠體內(nèi)弓形蟲的清除需要免疫相關(guān)GTPases（IRGs）和鳥苷酸結(jié)合蛋白（GBPs）以及自噬蛋白等的參與。然而,在IFN-γ刺激的人類細胞中,這些效應(yīng)器（如IRGs）不表達或功能不顯著（如GBPs）。那么,這些人類細胞如何抑制弓形蟲的生長?有報道稱IFN-γ能夠刺激HeLa細胞以非酸化依賴的方式抑制弓形蟲的生長。另有研究發(fā)現(xiàn)泛素、自噬受體p62和NDP52以及LC3等均能夠被招募至IFN-γ誘導(dǎo)的人細胞中弓形蟲的PVs附近,并特異性抑制弓形蟲的生長。也有研究表明,GABARAPL2而非LC3在IFN-γ誘導(dǎo)的小鼠清除弓形蟲的過程中發(fā)揮重要功能。但是,人類細胞與小鼠細胞在IFN-γ刺激的抑制弓形蟲感染的機制上存在差異。因此,驗證HeLa細胞中GABARAPL2在抑制弓形蟲感染中的作用至關(guān)重要。本研究首先采用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得了 GABARAPL2基因敲除的HeLa細胞系（GABARAPL2KO）,并通過免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)經(jīng)IFN-γ誘導(dǎo)的HeLa細胞中GABARAPL2能夠被募集至弓... 

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 綜述
    1.1 弓形蟲及弓形蟲病
    1.2 弓形蟲感染與宿主免疫
    1.3 IFN-γ抗弓形蟲感染免疫
        1.3.1 誘導(dǎo)吲哚胺2,3雙加氧酶(IDO)
        1.3.2 產(chǎn)生一氧化氮(NO)
        1.3.3 產(chǎn)生活性氧(ROS)
        1.3.4 IFN-γ誘導(dǎo)的免疫相關(guān)GTPase (IRGs)和鳥苷酸結(jié)合蛋白(GBPs)
        1.3.5 IFN-γ相關(guān)的非典型自噬
    1.4 研究目的及意義
第二章 研究報告
    2.1 材料和方法
        2.1.1 蟲株、細胞和載體
        2.1.2 主要儀器設(shè)備
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 弓形蟲和細胞的體外培養(yǎng)
        2.1.5 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄
        2.1.6 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.1.7 細胞基因敲除
        2.1.8 最佳藥物使用濃度篩選
        2.1.9 過表達細胞系的構(gòu)建
        2.1.10 Western blotting檢測
        2.1.11 間接免疫熒光試驗
        2.1.12 弓形蟲細胞內(nèi)復(fù)制試驗
        2.1.13 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 IFN-γ調(diào)節(jié)GABARAPL2募集于PVs
        2.2.2 GABARAPL2KO細胞系的構(gòu)建
        2.2.3 GABARAPL2抑制弓形蟲的生長
        2.2.4 IFN-γ及泛素調(diào)節(jié)GABARAPL2募集于弓形蟲PVs
        2.2.5 IFN-γ調(diào)節(jié)多種自噬受體募集于弓形蟲PV
        2.2.6 自噬受體p62、NDP52和OPTN敲除細胞系的構(gòu)建
        2.2.7 自噬受體的缺失影響GABARAPL2向PVs的募集
        2.2.8 ATG5缺失細胞系的構(gòu)建
        2.2.9 ATG5調(diào)節(jié)GABARAPL2向弓形蟲PV的募集
        2.2.10 FIP200募集于弓形蟲PVs
        2.2.11 IFN-γ調(diào)節(jié)下基因缺失細胞中PLK生長檢測
        2.2.12 IFN-γ調(diào)節(jié)的抑制弓形蟲感染模型
    2.3 討論
第三章 全文結(jié)論
參考文獻
致謝
作者簡歷



本文編號：3731896