MicroRNAs（miRNAs）是一類能夠?qū)蜻M(jìn)行廣泛調(diào)節(jié)的非編碼微小RNA,存在于真核生物體內(nèi)。已有研究表明它們能夠參與腫瘤形成、心臟發(fā)育、脂肪代謝、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和細(xì)胞的增殖分化等過程。此外有證據(jù)表明miRNA會影響毛囊的發(fā)育和生長周期。本課題組前期利用Solexa測序檢測了藏綿羊毛囊發(fā)育不同時期（休止期、生長期和衰退期）miRNAs的表達(dá)情況,試圖篩選出對毛囊發(fā)育過程有重要作用的miRNAs。測序結(jié)果表明毛囊從休止期到生長期的發(fā)育過程中,miR-148b和miR-320屬于上調(diào)表達(dá)倍數(shù)最高的一類miRNAs。為了進(jìn)一步驗證上述miRNA在毛囊發(fā)育過程中的具體作用及作用機(jī)制,本實驗以人毛乳頭細(xì)胞和人毛母質(zhì)細(xì)胞為材料,在體外研究了miR-148b和miR-320對其增殖情況的影響,推斷了miR-148b和miR-320在毛囊發(fā)育過程中的作用以及它們發(fā)揮作用可能涉及的信號通路。獲得結(jié)果如下： （1）Q-PCR的結(jié)果說明毛囊生長期miR-148b和miR-320的表達(dá)水平顯著高于休止期的表達(dá)情況,這與前期的測序結(jié)果相符。 （2）miR-148b可促進(jìn)人毛乳頭細(xì)胞和人毛母質(zhì)細(xì)... 

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
1 前言
    1.1 問題由來
    1.2 文獻(xiàn)綜述
        1.2.1 miRNAs研究概述
        1.2.2 miRNAs的研究方法和手段
        1.2.3 毛囊發(fā)育相關(guān)miRNAs的研究進(jìn)展
        1.2.4 miR-320調(diào)控毛囊發(fā)育的研究進(jìn)展
        1.2.5 miR-148b的研究進(jìn)展及其與毛囊發(fā)育的研究進(jìn)展
        1.2.6 Wnt信號通路與毛囊發(fā)育的研究進(jìn)展
    1.3 研究目的與意義
2 材料與方法
    2.1 技術(shù)路線
    2.2 實驗試劑和設(shè)備
        2.2.1 常用試劑
        2.2.2 實驗室常用設(shè)備
    2.3 組織樣品
    2.4 菌株、載體和細(xì)胞
        2.4.1 菌株
        2.4.2 載體
        2.4.3 細(xì)胞
    2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        2.5.1 轉(zhuǎn)染方法
        2.5.2 miRNA模擬物
    2.6 RNA提取與檢測
        2.6.1 RNA提取
        2.6.2 提取RNA的質(zhì)量檢測
    2.7 quantitative(Q)-PCR
    2.8 蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)(Western Blot)
        2.8.1 試劑配制和耗材
        2.8.2 蛋白樣品收集
        2.8.3 蛋白樣品濃度測定
        2.8.4 蛋白質(zhì)免疫印跡
    2.9 雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測miRNA與預(yù)測靶基因的結(jié)合位點
        2.9.1 雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)
        2.9.2 雙熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建
        2.9.3 細(xì)胞內(nèi)重組載體結(jié)合位點的驗證
        2.9.4 熒光素酶活性的檢測
    2.10 Wnt信號通路活性報告系統(tǒng)
        2.10.1 Wnt信號通路活性報告系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)
        2.10.2 PRL-TK載體結(jié)構(gòu)
    2.11 細(xì)胞增殖檢測方法
        2.11.1 Edu標(biāo)記染色檢測細(xì)胞增殖
        2.11.2 xCELLigene細(xì)胞實時定量監(jiān)控系統(tǒng)檢測細(xì)胞增殖
    2.12 生物信息學(xué)相關(guān)工具和網(wǎng)站
    2.13 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
3 結(jié)果
    3.0 藏綿羊基因組miR-148b和miR-320的序列克隆
    3.1 miR-148b和miR-320在藏綿羊毛囊發(fā)育不同時期的表達(dá)
    3.2 miR-148b和miR-320對人毛囊細(xì)胞增殖的影響
        3.2.1 Edu檢測miR-148b和miR-320對人毛乳頭細(xì)胞和人毛母質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞增殖的影響
        3.2.2 用xCELLigence檢測miR-148b和miR-320對人毛乳頭細(xì)胞和人毛母質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞增殖的影響
    3.3 miR-148b和miR-320對Wnt信號通路活性的影響
    3.4 miR-148b和miR-320對β-catenin表達(dá)變化的影響
    3.5 miR-148b和miR-320對Wnt通路下游轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響
    3.6 miR-148b在毛囊發(fā)育過程中發(fā)揮作用的靶基因的預(yù)測與驗證
        3.6.1 miR-148b在毛囊發(fā)育過程中發(fā)揮作用的靶基因的預(yù)測
        3.6.2 miR-148b在毛囊發(fā)育過程中重要靶基因的驗證
4 討論
    4.1 miR-148b和miR-320對毛囊細(xì)胞增殖的影響
    4.2 miR-148b和miR-320靶向調(diào)控Wnt信號通路的活性
    4.3 miR-148b和miR-320在毛囊發(fā)育過程中的作用及其機(jī)制
5 小結(jié)
    5.1 本研究的主要結(jié)果與結(jié)論
    5.2 本研究的創(chuàng)新點
    5.3 本研究的不足之處以及下一步工作建議
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]藏綿羊毛囊組織中microRNA-31的表達(dá)量變化[J]. 唐曉惠,柳廣斌,杜小勇,曹建華,李新云,羅章,余梅,趙書紅.  農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報. 2012(10)

博士論文
[1]Wnt5a抑制毛囊生長的體外及體內(nèi)實驗研究[D]. 星懿展.第三軍醫(yī)大學(xué) 2010
[2]MIR-29和MIR-195/497調(diào)節(jié)骨骼肌生長發(fā)育的功能研究[D]. 韋偉.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014
[3]Wnt10b與毛囊發(fā)育啟動中基板形成及其分布的關(guān)系[D]. 紀(jì)影暢.南方醫(yī)科大學(xué) 2010



本文編號：3711917