發(fā)布時(shí)間：2022-10-29 11:37

　　鴨疫里默氏桿菌（Riemerella antipestifer, RA）能引起鴨、鵝、火雞等多種禽類發(fā)生鴨疫里默氏桿菌感染,呈急性或慢性敗血性經(jīng)過。本研究對(duì)RA OmpA基因開展了生物信息學(xué)分析、克隆表達(dá)、蛋白純化、多克隆抗體制備、基于OmpA蛋白間接ELISA方法的建立、重組蛋白免疫原性等研究,主要結(jié)果如下：1 RA OmpA基因的生物信息學(xué)分析RA OmpA全基因長1208bp,由397個(gè)氨基酸編碼大小為43.52kDa的蛋白,等電點(diǎn)（pI）為4.81。該蛋白沒有信號(hào)肽切割位點(diǎn)和跨膜區(qū),有如下功能位點(diǎn)：有4個(gè)N-糖基化位點(diǎn),9個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn),7個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn),3個(gè)N-豆蔻�；稽c(diǎn)。亞細(xì)胞定位分析該蛋白主要分布于外膜和細(xì)胞之內(nèi)。氨基酸進(jìn)化樹分析表明該蛋白與黃桿菌科編碼OmpA蛋白的其它成員相似性低。該蛋白的抗原性分析表明第185-337位這段氨基酸有連續(xù)而且強(qiáng)烈的抗原性。2 RA OmpA基因的克隆表達(dá)和多抗的制備對(duì)RA OmpA基因設(shè)計(jì)了一對(duì)引物,大小為1208bp,構(gòu)建pJET1.2/OmpA克隆載體及其pET32a（+）OmpA表達(dá)載體,轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21... 

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮寫詞匯及其含義說明
一、引言
    1 鴨疫里默氏桿菌研究概況
    2 OmpA基因編碼蛋白的特點(diǎn)
        2.1 OmpA蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)
        2.2 OmpA蛋白的功能
            2.2.1 致病作用
            2.2.2 支撐細(xì)胞外膜骨架
            2.2.3 參與生物膜的形成
            2.2.4 作為外源蛋白的表面呈現(xiàn)載體
            2.2.5 免疫原性
    3 OmpA的基因特點(diǎn)
    4 OmpA其它特性
        4.1 中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶降解外膜蛋白殺滅大腸桿菌
        4.2 膜間質(zhì)分子伴侶Skp捕獲外膜蛋白
        4.3 外膜蛋白參與革蘭氏陰性菌對(duì)異丙醇耐受的調(diào)節(jié)
    5 研究的目的和意義
二、試驗(yàn)研究
    1 材料
        1.1 菌株、菌種、質(zhì)粒、血清和動(dòng)物
        1.2 試劑
        1.3 主要溶液的配制
            1.3.1 RA基因組提取相關(guān)試劑
            1.3.2 基因克隆相關(guān)試劑
            1.3.3 基因表達(dá)相關(guān)試劑
            1.3.4 弗氏不完全佐劑的配制
            1.3.5 Western-blot相關(guān)試劑的配制
            1.3.6 ELISA相關(guān)溶液的配制
        1.4 主要儀器設(shè)備
    2 方法
        2.1 鴨疫里默氏桿菌OmpA基因的生物信息學(xué)分析
        2.2 RA OmpA基因的克隆和表達(dá)
            2.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)及基因組DNA的提取
            2.2.2 RA OmpA基因引物設(shè)計(jì)與擴(kuò)增
            2.2.3 DH5 α感受態(tài)的制備、重組T克隆質(zhì)粒pJET1.2/OmpA的構(gòu)建及鑒定
            2.2.4 原核表達(dá)pET-32a(+)/OmpA重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定
            2.2.5 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)/OmpA的表達(dá)
            2.2.6 OmpA重組表達(dá)蛋白誘導(dǎo)條件的優(yōu)化
        2.3 OmpA重組表達(dá)蛋白的純化及鑒定
            2.3.1 OmpA重組表達(dá)蛋白的純化
            2.3.2 OmpA重組表達(dá)蛋白的鑒定
            2.3.3 兔抗重組OmpA蛋白多克隆抗體的制備
            2.3.4 兔抗OmpA IgG的純化與鑒定
        2.4 基于OmpA蛋白間接ELISA方法的建立
            2.4.1 鴨抗鴨疫里默氏桿菌ATCC株陽性血清的制備
            2.4.2 間接ELISA的基本操作程序
            2.4.3 抗原的最佳包被濃度和陰陽性血清最佳稀釋度的確定
            2.4.4 酶標(biāo)二抗最佳工作濃度的確定
            2.4.5 酶標(biāo)二抗作用時(shí)間的確定
            2.4.6 陰陽性血清最佳作用時(shí)間的確定
            2.4.7 封閉液的確定
            2.4.8 底物最佳作用時(shí)間確定
            2.4.9 陰陽性臨界值的確定
            2.4.10 重復(fù)性試驗(yàn)
            2.4.11 特異性試驗(yàn)
            2.4.12 符合性試驗(yàn)
        2.5 重組表達(dá)蛋白的免疫原性研究
            2.5.1 體液免疫水平的檢測
            2.5.2 細(xì)胞免疫水平的檢測
    3 結(jié)果
        3.1 鴨疫里默氏桿菌OmpA基因的生物信息學(xué)分析
            3.1.1 RA OmpA蛋白質(zhì)的組分析
            3.1.2 信號(hào)肽切割位點(diǎn)和跨膜區(qū)預(yù)測
            3.1.3 抗原性分析
            3.1.4 功能位點(diǎn)預(yù)測
            3.1.5 蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位分析
            3.1.6 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測與密碼子氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測
            3.1.7 密碼子偏性分析
            3.1.8 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析
        3.2 RA OmpA基因克隆表達(dá)、蛋白純化及抗體制備
            3.2.1 RA OmpA基因的擴(kuò)增、T克隆及亞克隆的構(gòu)建
            3.2.2 OmpA基因誘導(dǎo)表達(dá)、純化及Western blot檢測重組蛋白
            3.2.3 兔抗RA OmpA抗體效價(jià)的檢測及抗體IgG的粗提
        3.3 基于OmpA蛋白間接ELISA方法的建立
            3.3.1 抗原的最佳包被濃度和陰陽性血清最佳稀釋度的確定
            3.3.2 酶標(biāo)二抗最佳工作濃度的確定
            3.3.3 酶標(biāo)二抗作用時(shí)間的確定
            3.3.4 陰陽性血清最佳作用時(shí)間的確定
            3.3.5 封閉液的確定
            3.3.6 底物最佳作用時(shí)間確定
            3.3.7 陰陽性臨界值的確定
            3.3.8 重復(fù)性試驗(yàn)
            3.3.9 特異性試驗(yàn)
        3.4 重組表達(dá)蛋白的免疫原性研究
            3.4.1 人工免疫鴨抗體水平監(jiān)測結(jié)果
            3.4.2 細(xì)胞因子的檢測結(jié)果
    4 討論
        4.1 鴨疫里默氏桿菌OmpA基因的生物信息學(xué)分析
        4.2 RA OmpA基因的克隆表達(dá)、蛋白純化及抗體制備
        4.3 基于OmpA蛋白間接ELISA方法的建立
        4.4 重組表達(dá)蛋白的免疫原性研究
三、結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡介及攻讀碩士學(xué)位期間論文發(fā)表



本文編號(hào)：3697618