本文關(guān)鍵詞：表面展示金黃色葡萄球菌TRAP的大腸桿菌免疫原性及免疫保護(hù)性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：奶牛乳房炎是奶牛最常見疾病,由多種病原微生物引起,其中金黃色葡萄球菌和大腸桿菌是兩種最為常見的病原菌。隨著耐藥菌株的大量產(chǎn)生和對抗生素在奶牛乳房炎治療中的限制,促使人們研究和使用疫苗免疫接種來預(yù)防奶牛乳房炎。為了研制一種既可以抗金黃色葡萄球菌感染又可以抵抗大腸桿菌感染的疫苗,本研究將金黃色葡萄球菌的保守性抗原蛋白TRAP用大腸桿菌外膜蛋白OMPC展示在大腸桿菌表面,并研究其免疫原性。實(shí)驗(yàn)通過Overlap PCR的方法將金黃色葡萄球菌TRAP蛋白基因與大腸桿菌OmpC基因融合,并分別將OmpC-TRAP和OmpC連接在表達(dá)載體pET28a上,構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pCT和pC。然后將pCT和pC分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中,獲得的陽性表達(dá)菌株分別命名為BL21/pCT株和BL21/pC株。用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,獲得了與預(yù)期分子量一致的蛋白質(zhì),進(jìn)一步進(jìn)行全菌體蛋白和膜蛋白western-blot分析、全菌體ELISA檢測以及激光共聚焦顯微鏡觀察,證實(shí)TRAP蛋白展示在大腸桿菌表面。取8周齡ICR小鼠分為4組,即BL21/pCT組、BL21/pC組、TRAP組和PBS組。將抗原BL21/pCT全菌體、BL21/pC全菌體、TRAP蛋白和PBS分別與弗氏完全佐劑以1:1乳化后肌肉注射接種小鼠。初次免疫接種后3周以弗氏不完全佐劑乳化后加強(qiáng)免疫。加強(qiáng)免疫后1周檢測脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子水平;加強(qiáng)免疫后2周檢測小鼠血清抗體效價、抗體亞類,并用金黃色葡萄球菌Newman株和HLJ23-1株以及大腸桿菌2002-1株進(jìn)行攻毒。結(jié)果,用金黃色葡萄球菌Newman株、HLJ23-1株和E.coli 2002-1株的攻毒后,PBS對照組小鼠的存活率分別為10%、0、0時,BL21/pCT組小鼠的存活率最高,分別為為70%、70%、40%。重組菌BL21/pCT能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生高水平的抗金黃色葡萄球菌TRAP和大腸桿菌抗體,抗體亞類主要為IgG1和IgG2a;針對金黃色葡萄球菌TRAP和大腸桿菌裂解物刺激,脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生高水平的IFN-γ、IL-4和IL-17。結(jié)果表明,本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的BL21/PCT成功將金黃色葡萄球菌TRAP展示在大腸桿菌表面,能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較好的細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答,并誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生良好的抗金黃色葡萄球菌和大腸桿菌感染的免疫保護(hù)作用,為進(jìn)一步研究和開發(fā)新型奶牛乳房炎疫苗提供參考。
【關(guān)鍵詞】：大腸桿菌 外膜蛋白C 金黃色葡萄球菌 TRAP蛋白 表面展示 奶牛乳房炎疫苗
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.4
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 第一章 文獻(xiàn)綜述9-19
• 1.1 引言9
• 1.2 奶牛乳房炎疫苗的研究進(jìn)展9-14
• 1.2.1 金黃色葡萄球菌疫苗的研究進(jìn)展9-13
• 1.2.2 奶牛乳房炎大腸桿菌疫苗研究進(jìn)展13-14
• 1.3 革蘭氏陰性菌表面展示系統(tǒng)的研究進(jìn)展14-17
• 1.4 研究的目的與意義17-19
• 第二章 表面展示S.aureus TRAP的E.coli BL21菌株構(gòu)建19-41
• 2.1 材料19-22
• 2.1.1 質(zhì)粒及菌株19
• 2.1.2 工具酶及化學(xué)試劑19-20
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備20-22
• 2.2 方法22-30
• 2.2.1 引物的設(shè)計與合成22
• 2.2.2 模板DNA的獲取22-23
• 2.2.3 重組質(zhì)粒pCT和pC的構(gòu)建23-29
• 2.2.4 TRAP蛋白表面定位的鑒定29
• 2.2.5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理29-30
• 2.3 結(jié)果30-38
• 2.3.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果30
• 2.3.2 重疊延伸PCR方法融合OmpC和TRAP的基因30-31
• 2.3.3 重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果31-32
• 2.3.4 重組菌株BL21/pCT和BL21/pC測序鑒定結(jié)果32-36
• 2.3.5 重組菌株BL21/pCT和BL21/pC的生長曲線測定結(jié)果36
• 2.3.6 重組菌株Western-blotting檢測結(jié)果36-37
• 2.3.7 重組菌株全菌體ELISA檢測結(jié)果37-38
• 2.4 討論38-41
• 第三章 重組菌株BL21/pCT的免疫原性41-59
• 3.1 材料41
• 3.1.1 菌株和實(shí)驗(yàn)動物41
• 3.1.2 工具酶和化學(xué)試劑41
• 3.1.3 主要儀器41
• 3.2 方法41-47
• 3.2.1 免疫抗原的制備41-42
• 3.2.2 試驗(yàn)動物分組及免疫接種42-43
• 3.2.3 免疫接種小鼠攻毒43
• 3.2.4 間接ELISA測定抗體水平43-44
• 3.2.5 抗體亞類的檢測44-45
• 3.2.6 細(xì)胞因子的檢測45-47
• 3.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析47
• 3.3 結(jié)果47-55
• 3.3.1 TRAP蛋白純化結(jié)果47-48
• 3.3.2 小鼠攻毒試驗(yàn)結(jié)果48-49
• 3.3.3 血清特異性抗體水平檢測結(jié)果49-51
• 3.3.4 抗體亞類的檢測結(jié)果51-52
• 3.3.5 細(xì)胞因子檢測結(jié)果52-55
• 3.4 討論55-59
• 第四章 全文結(jié)論59-61
• 參考文獻(xiàn)61-69
• 致謝69-71
• 附錄71-77
• 個人簡介77

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：表面展示金黃色葡萄球菌TRAP的大腸桿菌免疫原性及免疫保護(hù)性研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：369633