發(fā)布時(shí)間：2017-05-16 01:06

  本文關(guān)鍵詞：豬miR-15b前體單堿基突變對(duì)其生物加工過程的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：MicroRNAs(miRNAs)是一類長(zhǎng)度為22nt左右的單鏈非編碼RNA,可與靶基因mRNA的3'UTR結(jié)合,降解mRNA或抑制mRNA翻譯。miR-15b是miR-15/16家族的一員,在細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期調(diào)控等生物學(xué)過程中發(fā)揮了重要功能。本研究發(fā)現(xiàn)了豬miR-15b前體發(fā)生了一個(gè)C/T突變,為了探究此突變對(duì)miR-15b生物加工過程的影響,分別在體外細(xì)胞水平和in vivo水平研究了此突變對(duì)miRNA及其前體表達(dá)量的影響。隨后又探究了mir-15b在豬不同組織中的表達(dá)差異性,獲得的主要研究結(jié)果如下:1.在長(zhǎng)白豬和杜洛克豬群體中發(fā)現(xiàn)pre-miR-15b第58位堿基發(fā)生了一個(gè)C/T突變(+58CT),T等位基頻率分別為0.03和0.36。榮昌豬群體中沒有發(fā)現(xiàn)此突變。2.利用Mfold和RNAfold預(yù)測(cè)突變前后pre-mi R-15b的二級(jí)結(jié)構(gòu)及其自由能,結(jié)果顯示+58CT突變改變了pre-miR-15b的二級(jí)結(jié)構(gòu),并使其自由能下降了11.01%。3.構(gòu)建野生型(CC)和突變型(TT)pre-miR-15b/mi R-16-1表達(dá)載體,分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,隨后利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)對(duì)miRNA及其前體的表達(dá)量進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染野生型表達(dá)載體的細(xì)胞內(nèi)mi R-15b-5p與miR-16的相對(duì)表達(dá)量約為轉(zhuǎn)染突變型表達(dá)載體的1.6倍(差異極顯著,P0.01),且pri-miR-15b與pre-mi R-15b兩者總的相對(duì)表達(dá)量也約為轉(zhuǎn)染突變型表達(dá)載體的1.6倍(差異極顯著,P0.01),轉(zhuǎn)染突變型表達(dá)載體細(xì)胞內(nèi)mi R-15b-3p的相對(duì)表達(dá)量約為轉(zhuǎn)染野生型表達(dá)載體的2.3倍,pri-miR-15b的相對(duì)表達(dá)量在轉(zhuǎn)染兩種不同質(zhì)粒的細(xì)胞內(nèi)基本相等(差異不顯著,P0.05)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染野生型表達(dá)載體的細(xì)胞內(nèi)miR-15b-5p與miR-15b-3p的比值為11:1,而轉(zhuǎn)染突變型表達(dá)載體的比值為3.5:1。4.利用qPCR對(duì)突變型和野生型杜洛克豬血液中miR-15b-5p和mi R-15b-3p的表達(dá)量進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生型豬血液中miR-15b-5p的表達(dá)量約為突變型豬的2倍(差異極顯著,P0.01),而突變型豬血液中miR-15b-3p的表達(dá)量約為野生型豬的5倍(差異極顯著,P0.01)。5.利用qPCR檢測(cè)榮昌豬不同組織內(nèi)miR-15b-5p的相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果顯示miR-15b-5p在胸腺和心臟組織高表達(dá),在肝臟組織表達(dá)量較低。本研究為進(jìn)一步研究miR-15b及+58CT突變的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ),同時(shí)也為miRNA突變的功能研究提供了新思路。
【關(guān)鍵詞】：豬 mi R-15b 前體 突變 表達(dá)量 鏈選擇
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S828
【目錄】：

• 摘要4-6
• Summary6-12
• 第一部分 文獻(xiàn)綜述12-30
• 1 MiRNA的研究進(jìn)展12-18
• 1.1 MiRNA的發(fā)現(xiàn)12-13
• 1.2 MiRNA家族及其命名13
• 1.3 動(dòng)物體miRNA的生物加工過程13-18
• 1.3.1 MiRNA的轉(zhuǎn)錄13-14
• 1.3.2 細(xì)胞核內(nèi)miRNA的加工過程14-16
• 1.3.3 細(xì)胞質(zhì)中miRNA的加工過程16-17
• 1.3.4 RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體的形成17-18
• 1.3.5 非經(jīng)典的miRNA生成途徑18
• 1.4 MiRNA的作用機(jī)制及其功能18
• 2 MiRNA突變對(duì)其功能的影響18-21
• 2.1 MiRNA突變對(duì)其加工過程及靶基因選擇的影響19-20
• 2.2 MiRNA突變引起諸多人類疾病20-21
• 3 MiR-15b的研究進(jìn)展21-25
• 3.1 MiR-15a/b家族簡(jiǎn)介21
• 3.2 MiR-15b的功能21-25
• 3.2.1 MiR-15b對(duì)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡的調(diào)控21-23
• 3.2.2 MiR-15b對(duì)細(xì)胞新陳代謝的調(diào)節(jié)23
• 3.2.3 MiR-15b在免疫細(xì)胞中的功能23-25
• 4 MiRNA的反轉(zhuǎn)錄與實(shí)時(shí)熒光定量PCR25-29
• 4.1 MiRNA成熟體的反轉(zhuǎn)錄與qPCR25-28
• 4.2 MiRNA前體的qPCR28-29
• 5 本研究的目的及意義29-30
• 第二部分 試驗(yàn)部分30-65
• 第一章 材料與方法30-49
• 1 試驗(yàn)材料30-33
• 1.1 試驗(yàn)動(dòng)物30
• 1.2 樣品采集30
• 1.3 細(xì)胞系及質(zhì)粒來源30-31
• 1.4 主要儀器設(shè)備31
• 1.5 主要試劑31-32
• 1.6 主要溶液及其配制32-33
• 2 試驗(yàn)方法33-49
• 2.1 基因組DNA的提取及檢測(cè)33-34
• 2.1.1 基因組DNA的提取33-34
• 2.1.2 基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)34
• 2.1.3 基因組DNA的分光光度計(jì)檢測(cè)34
• 2.2 基因多態(tài)性分析34-35
• 2.2.1 引物設(shè)計(jì)34
• 2.2.2 PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序34-35
• 2.2.3 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)35
• 2.2.4 PCR產(chǎn)物的測(cè)序35
• 2.3 Pre-miR-15b二級(jí)結(jié)構(gòu)及其自由能預(yù)測(cè)35-36
• 2.4 MiRNA表達(dá)載體的構(gòu)建36-42
• 2.4.1 目的片段的獲得36-37
• 2.4.2 重組T載體的構(gòu)建37-39
• 2.4.3 Pre-miR-15b重組質(zhì)粒的構(gòu)建39-42
• 2.5 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染42-44
• 2.5.1 細(xì)胞復(fù)蘇42-43
• 2.5.2 細(xì)胞傳代43
• 2.5.3 轉(zhuǎn)染43-44
• 2.6 細(xì)胞、組織與血液RNA的提取44-46
• 2.6.1 細(xì)胞、組織RNA的提取44-45
• 2.6.2 血液RNA的提取45-46
• 2.7 MiRNA的反轉(zhuǎn)錄與實(shí)時(shí)熒光定量PCR46-48
• 2.7.1 MiRNA的反轉(zhuǎn)錄46
• 2.7.2 MiRNA及其前體的qPCR46-48
• 2.8 數(shù)據(jù)處理方法48-49
• 2.8.1 群體遺傳分析48
• 2.8.2 熒光定量PCR數(shù)據(jù)處理48-49
• 第二章 結(jié)果與分析49-65
• 1 基因組DNA提取結(jié)果49
• 2 基因多態(tài)性分析結(jié)果49-51
• 2.1 Pre-miR-15b的PCR擴(kuò)增結(jié)果49-50
• 2.2 PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果50
• 2.3 基因型和等位基因頻率及分布50-51
• 3 突變前后pre-miR-15b二級(jí)結(jié)構(gòu)及其自由能預(yù)測(cè)結(jié)果51-53
• 4 +58C>T突變對(duì)miR-15b表達(dá)影響的體外驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果53-61
• 4.1 MiRNA重表達(dá)組質(zhì)粒的獲得53-54
• 4.1.1 Pre-miR-15b片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果53
• 4.1.2 目的片段的T載體克隆結(jié)果53-54
• 4.2 MiRNA重組表達(dá)載體的獲得54-56
• 4.2.1 雙酶切獲得目的片段及表達(dá)載體片段54-55
• 4.2.2 MiRNA重組質(zhì)粒的雙酶切檢測(cè)結(jié)果55-56
• 4.3 MiRNA表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染及細(xì)胞RNA提取結(jié)果56-57
• 4.4 qPCR及miRNA表達(dá)量分析結(jié)果57-61
• 4.4.1 miR-15b-5p及miR-15b-3p的相對(duì)表達(dá)量分析結(jié)果57-58
• 4.4.2 miR-15b前體的相對(duì)表達(dá)量分析結(jié)果58-59
• 4.4.3 MiR-15b-5p與miR-15b-3p相對(duì)表達(dá)量的比值分析結(jié)果59-60
• 4.4.4 MiR-16的相對(duì)表達(dá)量分析結(jié)果60-61
• 5 +58C>T突變對(duì)miR-15b表達(dá)影響的體內(nèi)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果61-63
• 5.1 新生小豬的基因分型及血液RNA的提取結(jié)果61-62
• 5.2 血液中miR-15b-5p/3p的相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果62-63
• 6 豬miR-15b不同組織表達(dá)差異性分析結(jié)果63-65
• 6.1 豬不同組織RNA提取結(jié)果63
• 6.2 MiR-15b不同組織表達(dá)差異性分析結(jié)果63-65
• 第三部分 討論65-71
• 1 關(guān)于試驗(yàn)方法的討論65
• 2 豬miR-15b基因的群體多態(tài)性及群體遺傳學(xué)分析65-67
• 3 Pre-miR-15bW/M二級(jí)結(jié)構(gòu)及其自由能分析67
• 4 +58C>T突變對(duì)pre-miR-15b的表達(dá)的影響67-70
• 5 MiR-15b-5p不同組織表達(dá)差異性分析70-71
• 第四部分 結(jié)論71-72
• 參考文獻(xiàn)72-84
• 致謝84-85
• 作者簡(jiǎn)介85-86
• 導(dǎo)師簡(jiǎn)介86-87

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本文編號(hào)：369259