CRISPR系統(tǒng)是原核生物的一種獲得性免疫系統(tǒng),近年來隨著CRISPR/Cas9研究的不斷發(fā)展,其基因編輯功能逐漸被應(yīng)用于各個(gè)生物學(xué)領(lǐng)域。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)靶標(biāo)序列的識(shí)別,輔助病毒基因的敲除和重組,可提高新毒株的獲得效率。皰疹病毒的基因組為線性雙鏈DNA分子,其中偽狂犬病病毒（PRV）和牛皰疹病毒（BHV）的基因組皆能通過sgRNA引導(dǎo),而被CRISPR/Cas9系統(tǒng)所編輯,可作為其他病毒基因敲除和重組的模式參考。本研究通過構(gòu)建含敲除目的基因左右同源臂的重組質(zhì)粒,當(dāng)目的基因被Cas9蛋白切開后,利用同源重組原理將目的基因替換為eGFP熒光標(biāo)記蛋白,從而達(dá)到基因敲除的目的,并將純化得到重組的皰疹病毒進(jìn)行生物學(xué)特性分析,建立了高效構(gòu)建皰疹病毒重組毒株的技術(shù)平臺(tái)。本論文的主要研究結(jié)果如下:1.構(gòu)建PRV TK^-/eGFP⁺毒株利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）從PRV Bartha-K61株基因組DNA中擴(kuò)增含TK啟動(dòng)子的TK基因同源臂左臂和TK基因同源臂右臂,與eGFP基因序列一起,順序克隆至克隆載體pUC19中,構(gòu)建重組載體pUC19-... 

【文章頁數(shù)】：60 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
文獻(xiàn)綜述
    第一章 CRISPR/Cas9 技術(shù)與皰疹病毒基因敲除的研究進(jìn)展
        1.1 CRISPR概述
            1.1.1 CRISPR/Cas9 研究歷史
            1.1.2 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)核心結(jié)構(gòu)
            1.1.3 CRISPR/Cas9 技術(shù)的應(yīng)用
        1.2 偽狂犬病毒及其重組研究
            1.2.1 PRV的國內(nèi)流行現(xiàn)狀
            1.2.2 PRV基因組特征
            1.2.3 PRV疫苗及重組研究
        1.3 牛皰疹病毒I型及其重組研究
            1.3.1 BHV的國內(nèi)流行現(xiàn)狀
            1.3.2 BHV基因組特征
            1.3.3 BHV疫苗及重組研究
        1.4 研究目的和意義
試驗(yàn)研究
    第二章 CRISPR/Cas9 技術(shù)在PRV基因敲除中的應(yīng)用
        2.1 材料
            2.1.1 毒種、細(xì)胞系和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            2.1.2 菌種和質(zhì)粒
            2.1.3 試劑
            2.1.4 培養(yǎng)基及緩沖液配制
        2.2 方法
            2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及病毒擴(kuò)增
            2.2.2 病毒基因組DNA提取
            2.2.3 重組載體構(gòu)建
            2.2.4 sgRNA載體構(gòu)建
            2.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
            2.2.6 病毒重組
            2.2.7 病毒蝕斑純化
            2.2.8 重組病毒純度測(cè)定
            2.2.9 重組病毒滴度測(cè)定
            2.2.10 重組病毒生長曲線測(cè)定
            2.2.11 重組病毒致病性測(cè)定
        2.3 結(jié)果
            2.3.1 重組載體構(gòu)建
            2.3.2 sgRNA載體構(gòu)建
            2.3.3 病毒基因組致病性
            2.3.4 TK啟動(dòng)子活性驗(yàn)證
            2.3.5 病毒重組
            2.3.6 病毒純化
            2.3.7 重組病毒純度檢測(cè)
            2.3.8 重組病毒生長特性
            2.3.9 重組病毒致病性
        2.4 討論
    第三章 CRISPR/Cas9 技術(shù)在BHV基因敲除中的應(yīng)用
        3.1 材料
            3.1.1 毒種、細(xì)胞系和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            3.1.2 菌種和質(zhì)粒
            3.1.3 試劑
            3.1.4 培養(yǎng)基及緩沖液配制
        3.2 方法
            3.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及病毒擴(kuò)增
            3.2.2 病毒基因組DNA提取
            3.2.3 重組載體構(gòu)建
            3.2.4 sgRNA載體構(gòu)建
            3.2.5 病毒重組
            3.2.6 病毒蝕斑純化
            3.2.7 重組病毒驗(yàn)證
            3.2.8 重組病毒滴度測(cè)定
            3.2.9 重組病毒生長曲線測(cè)定
            3.2.10 動(dòng)物抗體檢測(cè)
        3.3 結(jié)果
            3.3.1 重組載體構(gòu)建
            3.3.2 sgRNA載體構(gòu)建
            3.3.3 病毒重組
            3.3.4 病毒純化
            3.3.5 重組病毒純度檢測(cè)
            3.3.6 重組病毒生長特性
            3.3.7 動(dòng)物抗體檢測(cè)
        3.4 討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
[1]豬偽狂犬病病毒HeN1株全基因組測(cè)序與病毒遺傳變異分析[D]. 葉超.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2015
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本文編號(hào)：3682873