高致病性禽流感（highly pathogenic avian influenza,HPAI）是由一些H5和H7亞型禽流感病毒引起的高致病性和高死亡率的烈性禽類傳染病,對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的危害,并具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。DNA疫苗是可以有效防控禽流感的基因工程疫苗之一,已經(jīng)獲批一類新獸藥證書,現(xiàn)地應(yīng)用需要相應(yīng)配套的、更敏感的評(píng)價(jià)和檢測(cè)方法。因此,本研究擬建立一種比HI方法更為敏感的ELISA方法,為基因工程疫苗的推廣應(yīng)用提供必要的技術(shù)支撐。采用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)當(dāng)前主要流行毒株A/Chicken/Guizhou/4/2013（CK/GZ/4/13（H5N1））、A/Duck/Guizhou/S4184/2017（H5N6）（DK/GZ/S4184/2017（H5N6））和A/Chicken/Guangxi/SD098/2017（H7N9）（CK/GX/SD098/17（H7N9））的真核表達(dá)HA蛋白。分別以CK/GZ/4/13（H5N1）、CK/GX/SD098/2017（H7N9）和DK/GZ/S4184/2017（H5N6）的HA基因?yàn)槟０?將目的片段通過(guò)PCR擴(kuò)增克隆至昆蟲表... 

【文章頁(yè)數(shù)】：54 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 引言
    1.1 流感病毒的概述
    1.2 高致病性禽流感的危害
        1.2.1 H5亞型HPAIV的危害
        1.2.2 H7N9亞型HPAI的危害
    1.3 禽流感基因工程疫苗的研究進(jìn)展
        1.3.1 DNA疫苗的研究進(jìn)展
        1.3.2 禽流感基因重組活載體疫苗的研究進(jìn)展
        1.3.3 禽流感基因工程亞單位疫苗的研究進(jìn)展
    1.4 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展
    1.5 抗體檢測(cè)方法的研究進(jìn)展
        1.5.1 HI方法的概述
        1.5.2 NI方法的概述
        1.5.3 AGP方法的概述
        1.5.4 ELISA方法的研究進(jìn)展
        1.5.5 全自動(dòng)免疫發(fā)光法的進(jìn)展
    1.6 本研究的目的和意義
第二章 Clade2.3.4.4 H5亞型禽流感病毒HA蛋白的桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)
    2.1 材料與方法
        2.1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.2 重組質(zhì)粒pFastBac1-GZ4、pFastBac1-S4184 的構(gòu)建及鑒定
        2.1.3 rBacmid-GZ4、rBacmid-S4184 重組桿粒的構(gòu)建及鑒定
        2.1.4 重組病毒rBV-GZ4、rBV-S4184 的獲得及蛋白表達(dá)
        2.1.5 蛋白的大量制備及純化
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 重組質(zhì)粒pFastBac1-GZ4、pFastBac1-S4184 的構(gòu)建和鑒定
        2.2.2 重組桿粒reBacmid-GZ4、重組桿粒reBacmid-SD098的PCR鑒定
        2.2.3 桿狀病毒上清DNA的 PCR鑒定
        2.2.4 間接免疫熒光(IFA)鑒定HA蛋白的表達(dá)
        2.2.5 western blot鑒定HA蛋白的表達(dá)
        2.2.6 蛋白的大量表達(dá)及純化
    2.3 討論
第三章 H7亞型禽流感病毒HA蛋白的桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)
    3.1 材料與方法
        3.1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.2 重組質(zhì)粒pFastBac1-SD098的構(gòu)建
        3.1.3 rBacmid-SD098 重組桿粒的構(gòu)建及鑒定
        3.1.4 rBV-SD098 重組病毒的獲得及蛋白表達(dá)
        3.1.5 蛋白的大量制備及純化
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 重組質(zhì)粒pFastBac1-SD098的構(gòu)建和鑒定
        3.2.2 重組桿粒reBacmid-SD098的鑒定
        3.2.3 桿狀病毒上清DNA的 PCR鑒定
        3.2.4 間接免疫熒光(IFA)鑒定目的蛋白的表達(dá)
        3.2.5 western blot鑒定目的蛋白的表達(dá)
        3.2.6 蛋白的大量制備及純化
    3.3 討論
第四章 H5亞型禽流感間接ELISA抗體檢測(cè)方法的建立
    4.1 材料與方法
        4.1.1 試驗(yàn)用血清
        4.1.2 試驗(yàn)用試劑
        4.1.3 試驗(yàn)用儀器及耗材
        4.1.4 間接ELISA方法操作程序
        4.1.5 間接ELISA方法工作條件的確定
    4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.2.1 GZ4蛋白與血清的間接ELISA方法工作條件的優(yōu)化
    4.3 討論
第五章 H7亞型禽流感間接ELISA抗體檢測(cè)方法的建立
    5.1 材料與方法
        5.1.1 試驗(yàn)用血清
        5.1.2 試驗(yàn)試劑
        5.1.3 試驗(yàn)用儀器及耗材
        5.1.4 實(shí)驗(yàn)方法
    5.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.2.1 SD098蛋白與血清的間接ELISA方法的工作濃度的確定
    5.3 討論
第六章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)歷


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]一種更靈敏的特異性檢測(cè)H9亞型禽流感抗體的間接ELISA方法的建立[J]. 仉薇,侯力丹,宋潔,張爽,李蕓,李晶,孫蕾,范文輝,劉文軍.  生物工程學(xué)報(bào). 2017(08)
[2]An Overview of the Highly Pathogenic H5N1 Influenza Virus[J]. Jingchuan Yin,Shi Liu,Ying Zhu.  Virologica Sinica. 2013(01)
[3]H1亞型豬流感病毒血凝素基因在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)及其間接ELISA方法的初步建立[J]. 萬(wàn)春和,劉明,劉春國(guó),張曉霽,楊濤,劉大飛,陳浩,齊金龍,喬傳玲.  微生物學(xué)報(bào). 2008(02)



本文編號(hào)：3675040