本文關(guān)鍵詞：豬鏈球菌2型噬菌體裂解酶LyACCG的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域及關(guān)鍵氨基酸位點鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：豬鏈球菌2型(Streptococcus.suis 2,S.suis 2)是重要的人獸共患病原菌,臨床分離株普遍耐藥,傳統(tǒng)的抗生素療法面臨挑戰(zhàn),基于噬菌體裂解酶的抗菌策略再現(xiàn)潛力。噬菌體裂解細(xì)菌依賴于侵染后期合成的裂解酶,可特異高效地水解細(xì)菌細(xì)胞壁。噬菌體SMP是迄今為止國內(nèi)外分離到的唯一的一株S.suis 2烈性噬菌體,其編碼的裂解酶LyACCG(又叫LySMP)由N-端一個amidase-5(A5)催化域、中間兩個Cpl-7(C7)結(jié)合域及C-端一個glucosaminidase(G)催化域組成,為了鑒定LyACCG的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域及催化域A5的關(guān)鍵氨基酸位點,本研究:(一)LyACCG的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域鑒定。(1)原核表達LyACCG的各結(jié)構(gòu)域片段。以噬菌體SMP基因組為模板,分別PCR擴增編碼LyA、LyAC、LyACC、LyG、LyCG、LyCCG和LyACCG(依次對應(yīng)于LyACCG的第1-145、1-195、1-240、300-410、195-410、150-410和1-481位氨基酸)的基因片段,重組于pSJ2質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,1 mmol/L IPTG 27°C誘導(dǎo)表達,SDS-PAGE分析表明,各結(jié)構(gòu)域片段均為胞內(nèi)可溶性表達,其分子質(zhì)量依次約為19 ku、25 ku、30 ku、16 ku、28 ku、32 ku和56 ku,符合預(yù)期大小。(2)定性分析各結(jié)構(gòu)域片段的裂菌活性。大量培養(yǎng)收集各轉(zhuǎn)化菌,超聲破壁,離心取上清過濾,獲蛋白粗提液,平板裂解試驗檢測顯示,LyA、LyAC、LyACC和LyACCG(均含催化域A5)對S.suis 2強毒株HA9801的裂菌圈直徑依次為1.2 cm、1.7 cm、2.2 cm和1.3 cm,而LyG、LyCG和LyCCG(均含催化域G,不含催化域A5)均無裂菌活性,說明LyACCG的裂菌活性來自于催化域A5,催化域G無裂菌活性;LyA、LyAC、LyACC和LyACCG均可殺滅豬鏈球菌2型(12株)和7型,對豬鏈球菌9型、馬鏈球菌獸疫亞種、金黃色葡萄球菌(5株)、巴氏桿菌、大腸桿菌和沙門菌均無裂解作用,LyA的裂菌譜和LyACCG相同,表明LyACCG作用的細(xì)菌種屬特異性源自催化域A5,與結(jié)合域C7和催化域G無關(guān)。(3)定量比較LyA、LyAC、LyACC和LyACCG的裂菌活性。鎳離子親和層析純化LyA、LyAC、LyACC和LyACCG,以30 min內(nèi)能夠使108 cfu/mL的HA9801濁度下降一半的酶濃度為評價指標(biāo)(酶活單位/Unit),結(jié)果顯示,LyA、LyAC、LyACC和LyACCG的濃度依次為8.17μmol/mL、3.29μmol/m L、0.28μmol/m L和1.85μmol/mL;LyACCG的濃度是LyACC的7倍,說明催化域G對酶活性具有抑制作用;LyA和LyAC的濃度分別是LyACC的29和12倍,說明結(jié)合域C7對催化域A5的活性有促進作用,但不是決定作用。2μmol/m L的LyACC和LyACCG分別可使生物被膜內(nèi)的HA9801的細(xì)菌密度下降44.23%和14.44%,再證催化域G的存在抑制了酶活性。(4)LyACC裂菌活性的影響因素分析。LyACC的最適反應(yīng)pH=8.0,Fe2+和Mg2+對其裂菌活性沒有影響,Zn2+、Cu2+和高濃度的Ca2+會抑制其裂菌活性。(二)催化域A5的關(guān)鍵氨基酸位點鑒定。(1)催化域A5中各氨基酸位點的保守性分析。用NCBI、Uniport和Pfam數(shù)據(jù)庫,比對分析并計算催化域A5中各氨基酸位點的保守性,選擇11個高度保守的氨基酸位點(Y18、D30、C31、S32、G43、T53、G85、G92、G95、H96和I107)和3個保守性較低的氨基酸位點(E70、D73或D75)待突變。(2)高保守性氨基酸位點的突變。以質(zhì)粒pSJ2-lyacc為模板,將11個保守氨基酸位點的密碼子分別定點突變?yōu)楸彼?A),突變質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,1 mmol/L IPTG 27°C誘導(dǎo)表達的各突變依次命名為Y18A、D30A、C31A、S32A、G43A、T53A、G85A、G92A、G95A、H96A和I107A,SDS-PAGE分析表明,各突變體均為胞內(nèi)可溶性表達,分子質(zhì)量均約為30 ku,符合預(yù)期大小。(3)低保守性氨基酸位點的突變。以質(zhì)粒pSJ2-lyacc為模板,將3個低保守的氨基酸位點同時定點突變?yōu)榫彼?構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,1 mmol/L IPTG 27°C誘導(dǎo)表達的突變體命名為Ly7X,SDSPAGE分析表明,突變體Ly7X為胞內(nèi)可溶性表達,其分子質(zhì)量約為30 ku,符合預(yù)期大小。(4)各突變體的裂菌活性分析。各突變體的蛋白粗提液經(jīng)平板裂解試驗檢測顯示,突變體D30A、C31A、S32A、G43A、T53A和H96A的裂菌圈消失,徹底失去裂菌活性,說明D30、C31、S32、G43、T53和H96是LyACC的關(guān)鍵氨基酸位點;突變體Y18A、G85A、G92A、G95A和I107A的裂菌圈直徑較LyACC依次減小了0.9 cm、0.8 cm、0.3 cm、0.5 cm和0.3cm,說明Y18、G85、G92、G95和I107對LyACC的裂菌活性有重要作用;突變體Ly7X的裂菌圈直徑較LyACC減小了0.8 cm,說明保守性較低的E70、D73和D75對LyACC的裂菌活性也有重要作用。
【關(guān)鍵詞】：豬鏈球菌 噬菌體 裂解酶 分段表達 裂菌活性 關(guān)鍵氨基酸位點
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.611
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-8
• 縮略語表8-11
• 第一篇 文獻綜述11-23
• 1 豬鏈球菌11-14
• 1.1 概述11
• 1.2 流行病學(xué)11-12
• 1.3 豬鏈球菌的致病機制12-13
• 1.4 豬鏈球菌耐藥性的研究13-14
• 2 噬菌體14-18
• 2.1 噬菌體概述14-15
• 2.2 噬菌體療法15-16
• 2.3 豬鏈球菌噬菌體16-18
• 3 裂解酶18-22
• 3.1 裂解酶概述18-19
• 3.2 裂解酶的結(jié)構(gòu)組成19-20
• 3.3 細(xì)菌對裂解酶的耐藥性20-21
• 3.4 裂解酶的應(yīng)用21-22
• 4 展望22-23
• 第二篇 試驗部分23-56
• 第一章 LyACCG的結(jié)構(gòu)域片段表達23-33
• 1 材料方法23-29
• 1.1 試驗菌株和主要試劑23-24
• 1.2 LyACCG結(jié)構(gòu)域的預(yù)測24
• 1.3 PCR擴增24-25
• 1.4 原核表達載體的構(gòu)建25-26
• 1.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞26-27
• 1.6 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞27
• 1.7 各結(jié)構(gòu)域片段的原核表達27-28
• 1.8 SDS-PAGE分析原核表達的各結(jié)構(gòu)域片段28-29
• 2 結(jié)果29-31
• 2.1 LyACCG的結(jié)構(gòu)域組成29
• 2.2 PCR擴增結(jié)果29-30
• 2.3 PCR鑒定及測序分析30
• 2.4 各結(jié)構(gòu)域片段的原核表達30-31
• 3 結(jié)論31-33
• 第二章 裂解酶LyACCG的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域鑒定33-48
• 1 材料方法33-38
• 1.1 試驗菌株和主要試劑33-34
• 1.2 各結(jié)構(gòu)域片段的裂菌活性檢測34
• 1.3 LyA、LyAC、LyACC和LyACCG裂菌譜的測定34
• 1.4 LyA、LyAC、LyACC和LyACCG的鎳柱純化34-35
• 1.5 LyA、LyAC、LyACC和LyACCG的濃度測定35
• 1.6 LyA、LyAC、LyACC和LyACCG的酶活單位測定35-36
• 1.7 LyACC和LyACCG生物被膜清除能力測定36
• 1.8 LyACC的離子純化36
• 1.9 LyACC的酶活單位測定36-37
• 1.10 LyACC最適反應(yīng)pH的測定37
• 1.11 還原劑對LyACC裂菌活性的影響37
• 1.12 金屬離子對LyACC裂菌活性的影響37-38
• 2 結(jié)果38-45
• 2.1 各結(jié)構(gòu)域片段的裂菌活性38
• 2.2 LyA、LyAC、LyACC和LyACCG的裂菌譜38-40
• 2.3 鎳柱純化的LyA、LyAC、LyACC和LyACCG的SDS-PAGE分析40
• 2.4 LyA、LyAC、LyACC和LyACCG的濃度40
• 2.5 LyA、LyAC、LyACC和LyACCG的酶活單位40-41
• 2.6 LyACC和LyACCG清除HA9801生物被膜的效率41-42
• 2.7 SDS-PAGE分析離子純化的LyACC42
• 2.8 LyACC的酶活單位42
• 2.9 LyACC的最適反應(yīng)pH42-43
• 2.10 還原劑對LyACC裂菌活性的影響43
• 2.11 金屬離子對LyACC裂菌活性的影響43-45
• 3 討論45-48
• 第三章 催化域A5的關(guān)鍵氨基酸位點鑒定48-56
• 1 材料與方法48-51
• 1.1 試驗菌株和主要試劑48
• 1.2 催化域A5中各氨基酸位點的保守性分析48
• 1.3 催化域A5中保守氨基酸位點的選擇與突變48-50
• 1.4 催化域A5中保守性較低的酸性氨基酸位點的篩選與突變50-51
• 1.5 LyACC及其突變體的原核表達51
• 1.6 LyACC及其突變體的裂菌活性檢測51
• 2 結(jié)果51-54
• 2.1 催化域A5中保守氨基酸位點的選擇及突變結(jié)果51-52
• 2.2 催化域A5中保守性較低的酸性氨基酸位點的選擇及突變結(jié)果52-53
• 2.3 LyACC及其突變體的裂菌活性53-54
• 3 討論54-56
• 結(jié)論56-57
• 參考文獻57-65
• 附錄 試劑配制65-67
• 致謝67-68
• 導(dǎo)師簡介68-70
• 作者簡介70-71

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  本文關(guān)鍵詞：豬鏈球菌2型噬菌體裂解酶LyACCG的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域及關(guān)鍵氨基酸位點鑒定，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：366282