巴貝斯蟲病是一種由巴貝斯蟲感染引起的人獸共患原蟲病。巴貝斯蟲主要寄生于哺乳動物紅細(xì)胞,在紅細(xì)胞內(nèi)繁殖,在此過程中,巴貝斯蟲處于有氧環(huán)境,受到活性氧（ROS）的毒性效應(yīng)。巴貝斯蟲為了抵抗氧化應(yīng)激,啟動體內(nèi)的硫氧還蛋白（Trx）系統(tǒng)。硫氧還蛋白還原酶（TrxR）是一種NADPH依賴的包含F(xiàn)AD結(jié)合結(jié)構(gòu)域的二聚體硒酶,屬于吡啶核苷酸-二硫化物氧化還原酶家族成員,它參與防御氧化應(yīng)激,與硫氧還蛋白（Trx）共同構(gòu)成關(guān)鍵的硫氧還蛋白抗氧化系統(tǒng)。本研究是在實(shí)驗(yàn)室前期克隆和初步鑒定的田鼠巴貝斯蟲硫氧還蛋白還原酶（Bmi TrxR）酶的基礎(chǔ)上,研究了TrxR的抗氧化功能,并將TrxR分子的關(guān)鍵氨基酸突變,研究突變位點(diǎn)對TrxR酶活的影響,確認(rèn)TrxR的關(guān)鍵催化位點(diǎn),為藥物篩選提供研究基礎(chǔ)。通過對感染小鼠紅細(xì)胞內(nèi)TrxR和ROS的檢測發(fā)現(xiàn),隨著染蟲率的升高,ROS與TrxR也隨之升高,表明TrxR參與抗氧化應(yīng)激。通過結(jié)構(gòu)域預(yù)測與同源性分析,確定了TrxR的活性位點(diǎn),構(gòu)建6個突變體Bmi TrxR C105,Bmi TrxR C110,Bmi TrxR C105C110,Bmi TrxR C547,Bmi ... 

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
主要符號表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 TrxR的結(jié)構(gòu)
    1.2 TrxR的分類
    1.3 TrxR的還原機(jī)制
    1.4 TrxR的功能
        1.4.1 參與機(jī)體炎癥
        1.4.2 參與腫瘤進(jìn)展
        1.4.3 參與抗毒素
        1.4.4 參與氧化應(yīng)激
        1.4.5 參與細(xì)胞凋亡
    1.5 總結(jié)
第二章 Bmi TrxR抗氧化應(yīng)激功能的研究
    2.1 引言
    2.2 材料與儀器
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.2.3 實(shí)驗(yàn)動物
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 蟲體凍存與復(fù)蘇
        2.3.2 田鼠巴貝斯蟲的觀察
        2.3.3 Bmi TrxR體內(nèi)抗氧化應(yīng)激功能研究
            2.3.3.1 樣品收集
            2.3.3.2 田鼠巴貝斯蟲蟲體數(shù)檢測
            2.3.3.3 Bmi TrxR相對表達(dá)水平檢測
            2.3.4.4 感染的紅細(xì)胞中活性氧(ROS)的測定
        2.3.4 Bmi TrxR體外抗氧化應(yīng)激功能研究
            2.3.4.1 體外培養(yǎng)
            2.3.4.2 細(xì)胞樣本收集
            2.3.4.3 染色
            2.3.4.4 流式上機(jī)
    2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.4.1 Bmi TrxR參與抗氧化應(yīng)激的體內(nèi)驗(yàn)證
        2.4.2 Bmi TrxR參與抗氧化應(yīng)激的體外驗(yàn)證
    2.5 討論
第三章 Bmi TrxR生物信息學(xué)分析、定點(diǎn)突變、蛋白表達(dá)純化
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 Bmi TrxR的生物信息學(xué)分析
        3.3.2 TrxR質(zhì)粒提取
        3.3.3 引物設(shè)計(jì)
        3.3.4 定點(diǎn)突變
        3.3.5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
        3.3.6 重組蛋白Bmi TrxR和突變體蛋白的純化
        3.3.7 蛋白濃度測定
            3.3.7.1 BSA方法
            3.3.7.2 BCA方法
    3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.4.1 Bmi TrxR的生物信息學(xué)分析
        3.4.2 定點(diǎn)突變及其蛋白表達(dá)純化
    3.5 討論
第四章 突變體蛋白酶活實(shí)驗(yàn)以及抑制實(shí)驗(yàn)
    4.1 前言
    4.2 實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)儀器
        4.2.1 試劑準(zhǔn)備
        4.2.2 主要儀器
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 重組酶Bmi TrxR和突變體的DTNB還原酶活性檢測
        4.3.2 突變株的Trx還原酶活性檢測
        4.3.3 重組酶BmiTrxR以及突變體的抑制實(shí)驗(yàn)
    4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.4.1 TrxR酶活驗(yàn)證和抑制劑篩選
        4.4.2 His標(biāo)簽對TrxR還原活性的影響
        4.4.3 突變位點(diǎn)對Bmi TrxR的酶活性影響
        4.4.4 抑制劑對突變體的抑制作用
    4.5 討論
第五章 全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
附錄
作者簡介
攻讀學(xué)位期間取得的研究成果
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]田鼠巴貝斯蟲醛酮還原酶BmAKR2的基因克隆和鑒定[J]. 黃強(qiáng),曹杰,周勇志,龔海燕,張厚雙,周金林.  中國獸醫(yī)科學(xué). 2017(10)
[2]活性氧與細(xì)胞核共染影響因素的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 羅莉,侯鳳艷,嚴(yán)軍,梁華平.  第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào). 2016(06)
[3]硫氧還蛋白還原酶的生理學(xué)功能研究進(jìn)展[J]. 周潤梅.  現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生. 2012(16)

碩士論文
[1]田鼠巴貝斯蟲兩個硫氧還蛋白基因的克隆及鑒定[D]. 熊康.上海師范大學(xué) 2016
[2]田鼠巴貝斯蟲隱性感染小鼠試驗(yàn)及其對其他原蟲共感染的影響[D]. 魏金龍.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015
[3]剛地弓形蟲SHR蟲株生物學(xué)特性初步研究[D]. 朱丙倫.廣西大學(xué) 2015



本文編號：3650075