弓形蟲是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生頂復(fù)門原蟲,能夠引起人和許多動物的感染。弓形蟲包囊被人誤食后,會在體內(nèi)經(jīng)過緩殖子和速殖子的發(fā)育隨血液流經(jīng)全身,從而感染人類。傳統(tǒng)的抗弓形蟲藥物存在副作用大等缺陷,因此急需開發(fā)高效的新型治療藥物。最近的研究證明弓形蟲具有高度極化的分泌系統(tǒng),并利用其將蛋白分子分泌到蟲體外和宿主細(xì)胞中。這些分泌蛋白在弓形蟲的入侵和感染建立過程中都具有至關(guān)重要的作用。后高爾基體網(wǎng)絡(luò)承擔(dān)向蟲體質(zhì)膜、質(zhì)膜下網(wǎng)絡(luò)和頂端分泌細(xì)胞器分發(fā)轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡的運(yùn)輸功能。弓形蟲如何完成復(fù)雜的囊泡運(yùn)輸尚不清楚。SNARE復(fù)合物是囊泡融合的關(guān)鍵復(fù)合物,通過形成拉鏈結(jié)構(gòu)來驅(qū)動膜融合。Sec1/Munc18-like（SM）蛋白是調(diào)控SNARE復(fù)合物的關(guān)鍵元件蛋白。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)弓形蟲編碼4個(gè)SM蛋白（TgVps45、TgSec1、TgVps33以及TgSly1）。本研究通過CRISPR/Cas9基因編輯和植物生長素誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解技術(shù)（AID）,成功構(gòu)建了弓形蟲TgVps45和TgSec1條件性敲除蟲株。通過間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)一部分弓形蟲TgVps45蛋白存在于TGN與ELC之間的隔室。TgVps45蛋白... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 弓形蟲及弓形蟲病
    1.2 抗弓形蟲藥物的研究現(xiàn)狀
    1.3 弓形蟲基因編輯技術(shù)
        1.3.1 基因編輯技術(shù)的發(fā)展
        1.3.2 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在弓形蟲基因編輯中的應(yīng)用
        1.3.3 弓形蟲的條件敲除系統(tǒng)
    1.4 弓形蟲蛋白的分泌途徑
    1.5 SM-SNRAE復(fù)合物作為藥物靶點(diǎn)的研究現(xiàn)狀
    1.6 目的和意義
第二章 TgVps45-TgStx16 復(fù)合物作為潛在藥物靶點(diǎn)的功能研究
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 主要儀器
        2.1.2 主要材料
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 弓形蟲編碼SM-SNARE復(fù)合物的序列分析
        2.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建
        2.2.3 單克隆蟲株的構(gòu)建、篩選和鑒定
        2.2.4 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)
        2.2.5 弓形蟲噬斑實(shí)驗(yàn)
        2.2.6 弓形蟲入侵水平檢測
        2.2.7 弓形蟲逸出水平檢測
        2.2.8 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)
        2.2.9 透射電鏡實(shí)驗(yàn)
        2.2.10 Brefeldin A處理實(shí)驗(yàn)
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 TgSM蛋白序列分析
        2.3.2 TgSNARE蛋白序列分析
        2.3.3 TgVps45條件敲除蟲株的構(gòu)建
        2.3.4 TgStx16條件敲除蟲株的構(gòu)建
        2.3.5 TgVps45蛋白的亞細(xì)胞定位
        2.3.6 TgVps45和TgStx16 的相互作用
        2.3.7 TgStx16 蛋白與TgVps45 蛋白的共定位
        2.3.8 TgVps45基因缺失對蟲體表型的影響
        2.3.9 TgStx16基因缺失對蟲體表型的影響
        2.3.10 電鏡觀察TgVps45缺失引起的超微結(jié)構(gòu)變化
        2.3.11 TgVps45基因缺失對內(nèi)膜復(fù)合物的影響
        2.3.12 TgVps45基因缺失對后高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)的影響
        2.3.13 TgVps45基因缺失對分泌性細(xì)胞器的影響
        2.3.14 TgStx16基因缺失對內(nèi)膜復(fù)合物的影響
        2.3.15 TgStx16基因缺失對分泌性細(xì)胞器的影響
        2.3.16 Brefeldin A對 TgVps45 定位的影響
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第三章 TgSec1作為潛在藥物靶點(diǎn)的功能研究
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 主要儀器
        3.1.2 主要材料
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建
        3.2.2 單克隆蟲株的構(gòu)建、篩選和鑒定
        3.2.3 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)
        3.2.4 弓形蟲噬斑實(shí)驗(yàn)
        3.2.5 弓形蟲入侵水平檢測
        3.2.6 弓形蟲復(fù)制水平檢測
        3.2.7 弓形蟲逸出水平檢測
        3.2.8 透射電鏡實(shí)驗(yàn)
        3.2.9 Brefeldin A處理實(shí)驗(yàn)
        3.2.10 微線體分泌實(shí)驗(yàn)
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 TgSec1條件敲除蟲株的構(gòu)建
        3.3.2 TgSec1蛋白的亞細(xì)胞定位
        3.3.3 TgSec1基因缺失對蟲體表型的影響
        3.3.4 電鏡觀察TgSec1缺失引起的超微結(jié)構(gòu)變化
        3.3.5 TgSec1基因缺失對外膜的影響
        3.3.6 TgSec1基因缺失對分泌性細(xì)胞器的影響
        3.3.7 Brefeldin A對 TgSec1 定位的影響
        3.3.8 TgSec1微線體分泌實(shí)驗(yàn)
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第四章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡歷



本文編號：3640700