弓形蟲是一種專性細胞內寄生頂復門原蟲,能夠引起人和許多動物的感染。弓形蟲包囊被人誤食后,會在體內經(jīng)過緩殖子和速殖子的發(fā)育隨血液流經(jīng)全身,從而感染人類。傳統(tǒng)的抗弓形蟲藥物存在副作用大等缺陷,因此急需開發(fā)高效的新型治療藥物。最近的研究證明弓形蟲具有高度極化的分泌系統(tǒng),并利用其將蛋白分子分泌到蟲體外和宿主細胞中。這些分泌蛋白在弓形蟲的入侵和感染建立過程中都具有至關重要的作用。后高爾基體網(wǎng)絡承擔向蟲體質膜、質膜下網(wǎng)絡和頂端分泌細胞器分發(fā)轉運囊泡的運輸功能。弓形蟲如何完成復雜的囊泡運輸尚不清楚。SNARE復合物是囊泡融合的關鍵復合物,通過形成拉鏈結構來驅動膜融合。Sec1/Munc18-like（SM）蛋白是調控SNARE復合物的關鍵元件蛋白。通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)弓形蟲編碼4個SM蛋白（TgVps45、TgSec1、TgVps33以及TgSly1）。本研究通過CRISPR/Cas9基因編輯和植物生長素誘導的蛋白質降解技術（AID）,成功構建了弓形蟲TgVps45和TgSec1條件性敲除蟲株。通過間接免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)一部分弓形蟲TgVps45蛋白存在于TGN與ELC之間的隔室。TgVps45蛋白... 

【文章來源】：中國農業(yè)科學院北京市

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 弓形蟲及弓形蟲病
    1.2 抗弓形蟲藥物的研究現(xiàn)狀
    1.3 弓形蟲基因編輯技術
        1.3.1 基因編輯技術的發(fā)展
        1.3.2 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在弓形蟲基因編輯中的應用
        1.3.3 弓形蟲的條件敲除系統(tǒng)
    1.4 弓形蟲蛋白的分泌途徑
    1.5 SM-SNRAE復合物作為藥物靶點的研究現(xiàn)狀
    1.6 目的和意義
第二章 TgVps45-TgStx16 復合物作為潛在藥物靶點的功能研究
    2.1 實驗材料
        2.1.1 主要儀器
        2.1.2 主要材料
    2.2 實驗方法
        2.2.1 弓形蟲編碼SM-SNARE復合物的序列分析
        2.2.2 質粒構建
        2.2.3 單克隆蟲株的構建、篩選和鑒定
        2.2.4 間接免疫熒光實驗
        2.2.5 弓形蟲噬斑實驗
        2.2.6 弓形蟲入侵水平檢測
        2.2.7 弓形蟲逸出水平檢測
        2.2.8 免疫共沉淀實驗
        2.2.9 透射電鏡實驗
        2.2.10 Brefeldin A處理實驗
    2.3 實驗結果
        2.3.1 TgSM蛋白序列分析
        2.3.2 TgSNARE蛋白序列分析
        2.3.3 TgVps45條件敲除蟲株的構建
        2.3.4 TgStx16條件敲除蟲株的構建
        2.3.5 TgVps45蛋白的亞細胞定位
        2.3.6 TgVps45和TgStx16 的相互作用
        2.3.7 TgStx16 蛋白與TgVps45 蛋白的共定位
        2.3.8 TgVps45基因缺失對蟲體表型的影響
        2.3.9 TgStx16基因缺失對蟲體表型的影響
        2.3.10 電鏡觀察TgVps45缺失引起的超微結構變化
        2.3.11 TgVps45基因缺失對內膜復合物的影響
        2.3.12 TgVps45基因缺失對后高爾基體轉運的影響
        2.3.13 TgVps45基因缺失對分泌性細胞器的影響
        2.3.14 TgStx16基因缺失對內膜復合物的影響
        2.3.15 TgStx16基因缺失對分泌性細胞器的影響
        2.3.16 Brefeldin A對 TgVps45 定位的影響
    2.4 討論
    2.5 小結
第三章 TgSec1作為潛在藥物靶點的功能研究
    3.1 實驗材料
        3.1.1 主要儀器
        3.1.2 主要材料
    3.2 實驗方法
        3.2.1 質粒構建
        3.2.2 單克隆蟲株的構建、篩選和鑒定
        3.2.3 間接免疫熒光實驗
        3.2.4 弓形蟲噬斑實驗
        3.2.5 弓形蟲入侵水平檢測
        3.2.6 弓形蟲復制水平檢測
        3.2.7 弓形蟲逸出水平檢測
        3.2.8 透射電鏡實驗
        3.2.9 Brefeldin A處理實驗
        3.2.10 微線體分泌實驗
    3.3 實驗結果
        3.3.1 TgSec1條件敲除蟲株的構建
        3.3.2 TgSec1蛋白的亞細胞定位
        3.3.3 TgSec1基因缺失對蟲體表型的影響
        3.3.4 電鏡觀察TgSec1缺失引起的超微結構變化
        3.3.5 TgSec1基因缺失對外膜的影響
        3.3.6 TgSec1基因缺失對分泌性細胞器的影響
        3.3.7 Brefeldin A對 TgSec1 定位的影響
        3.3.8 TgSec1微線體分泌實驗
    3.4 討論
    3.5 小結
第四章 全文結論
參考文獻
致謝
作者簡歷



本文編號：3640700