近年來,CRISPR/Cas9技術(shù)快速發(fā)展,其作為靶向基因組修飾的有效工具,引入特定的DNA雙鏈斷裂（DSB）,再通過內(nèi)源DNA修復(fù)機(jī)制完成修復(fù)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)被廣泛地運用于動物遺傳工程,在動物基因組中產(chǎn)生敲除、插入和點突變。相比于傳統(tǒng)的ZFN和TALEN基因編輯技術(shù),其效率更高且序列選擇的限制更少（基因組中只需要GG）,它的構(gòu)建程序簡單方便,適用于大規(guī)模的動物基因編輯。綿羊是一種重要的經(jīng)濟(jì)動物,同時也是遺傳病生物醫(yī)學(xué)中不可或缺的大動物模型。在綿羊基因組中應(yīng)用基因編輯技術(shù)可以促進(jìn)品種改良,提高家畜育種水平,使動物表型快速向人們期望的方向變化。肌肉發(fā)育是家畜的重要經(jīng)濟(jì)特征之一,而肌肉生長抑制素（MSTN）基因被認(rèn)為是與肌肉發(fā)育和瘦肉率相關(guān)的主要基因。在大多數(shù)研究中,通過設(shè)計sgRNA來靶向至目的基因,從而實現(xiàn)基因敲除。然而,較少的基因堿基突變對目的基因的功能影響可能很小,特別是對雜合子羊或嵌合體羊。因此,進(jìn)一步研究大的基因片段敲除是有必要的。因此,本試驗旨在利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)來對綿羊的MSTN基因進(jìn)行敲除以探究其作用效果。本研究以寧夏灘羊為對象,選擇肌肉生長抑制素... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省211工程院校985工程院校教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 基因編輯技術(shù)-CRISPR/Cas9 技術(shù)
        1.1.1 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的發(fā)展和應(yīng)用
        1.1.2 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的基本工作特點
        1.1.3 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的應(yīng)用
        1.1.4 動物遺傳育種方面的應(yīng)用
    1.2 MSTN基因研究進(jìn)展
        1.2.1 MSTN的結(jié)構(gòu)分析
        1.2.2 MSTN的作用機(jī)制
        1.2.3 MSTN的功能和應(yīng)用
    1.3 研究目的與意義
第二章 MSTN基因敲除灘羊的制備與評價
    2.1 材料與方法
        2.1.1 試驗動物
        2.1.2 sgRNA載體質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
        2.1.4 細(xì)胞編輯效率檢測
        2.1.5 脫靶檢測
        2.1.6 T-A單克隆基因分型
        2.1.7 Cas9mRNA的體外轉(zhuǎn)錄
        2.1.8 sgRNA的體外轉(zhuǎn)錄
        2.1.9 受精卵顯微注射Cas9mRNA和 sgRNA
        2.1.10 新生羔羊的基因編輯效率檢測
        2.1.11 基因編輯羔羊的脫靶效應(yīng)檢測
        2.1.12 Western印跡分析
        2.1.13 基因編輯綿羊表型分析
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 胎兒成纖維細(xì)胞的MSTN基因敲除效率驗證
        2.2.2 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的基因編輯綿羊的效率驗證
        2.2.3 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的基因編輯綿羊的脫靶效應(yīng)檢測
        2.2.4 MSTN基因敲除綿羊肌肉組織中MSTN表達(dá)分析
        2.2.5 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)介導(dǎo)的基因敲除灘羊的表型分析
    2.3 討論
    2.4 小結(jié)
第三章 結(jié)論
    3.1 研究結(jié)論
    3.2 創(chuàng)新點
    3.3 下一步的研究內(nèi)容
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
作者簡介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]同源重組及非同源末端連接修復(fù)途徑介導(dǎo)的基因編輯:CRISPR技術(shù)的認(rèn)知、應(yīng)用及展望[J]. 朱娉慧,羅群,王曜峰,馮波.  生命科學(xué). 2018(09)
[2]基因編輯技術(shù)[J]. 胡小丹,游敏,羅文新.  中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報. 2018(03)
[3]基因編輯技術(shù)及其在畜牧業(yè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 李莉,畢延震,華再東,任紅艷,肖紅衛(wèi),劉西梅,鄭新民.  基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué). 2016(12)
[4]CRISPR/Cas9系統(tǒng)在雞MSTN上的效率驗證[J]. 胡曼,康倩倩,胡曉湘,李寧.  中國家禽. 2016(07)
[5]力竭運動及恢復(fù)期間大鼠骨骼肌及心肌MSTN、TGF-β、PDGF含量的變化[J]. 潘同斌,唐芳,李娜,馬兵,仝昕煒.  中國運動醫(yī)學(xué)雜志. 2015(11)
[6]基因組編輯技術(shù)研究新進(jìn)展[J]. 毛超,陶永光.  生命的化學(xué). 2015(01)
[7]基因編輯技術(shù)在基因治療中的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 季海艷,朱煥章.  生命科學(xué). 2015(01)
[8]灘羊毛皮特性及毛囊發(fā)育相關(guān)基因的研究進(jìn)展[J]. 額爾和花,丁偉,李穎康,王天新.  畜牧與飼料科學(xué). 2010(05)
[9]豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白基因在持續(xù)感染中的遺傳變異分析[J]. 李軍,楊威,曾蕓,張遠(yuǎn)波,陳澤祥,黃偉堅.  中國獸醫(yī)雜志. 2009(06)
[10]我國的珍貴綿羊品種[J]. 金江.  當(dāng)代畜禽養(yǎng)殖業(yè). 1999(08)

博士論文
[1]基于CRISPR/Cas9的豬胚胎成纖維細(xì)胞基因組編輯及MSTN基因遺傳修飾豬的制備[D]. 王侃侃.吉林大學(xué) 2018
[2]雙sgRNA策略便利于CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組改造和動物模型構(gòu)建[D]. 周建奎.南京大學(xué) 2016

碩士論文
[1]灘羊羔羊早期補(bǔ)飼以及不同體重階段羊肉品質(zhì)的研究[D]. 侯鵬霞.寧夏大學(xué) 2014
[2]灘羊肉品質(zhì)研究[D]. 錢文熙.寧夏大學(xué) 2005



本文編號：3640393