JSRV-env慢病毒過表達(dá)載體構(gòu)建及其對NIH3T3細(xì)胞增殖的影響
發(fā)布時間：2022-01-21 08:23
為研究綿羊肺腺瘤病毒（Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV）囊膜蛋白（Envelope,env）對NIH3T3細(xì)胞（小鼠胚胎成纖維細(xì)胞）增殖的影響,構(gòu)建pCMV-dR8.91-JSRV-env慢病毒過表達(dá)載體并感染NIH3T3細(xì)胞。將JSRV-env基因連接紅色熒光慢病毒報告載體pCMV-dR8.91,基因測序正確后將載體命名為pCMV-dR8.91-JSRV-env。將pCMV-dR8.91-JSRV-env重組質(zhì)粒和包裝輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞包裝產(chǎn)生JSRV-env重組慢病毒。將重組慢病毒懸液利用超速離心沉淀法濃縮,real-time PCR測定病毒滴度。濃縮病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)NIH3T3細(xì)胞72h后,噻唑藍(lán)（MTT）檢測細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示:env同源重組入pCMV-dR8.91載體,測序結(jié)果與預(yù)期序列一致;pCMV-dR8.91-JSRV-env與包裝輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞72h,real-time PCR驗證JSRV-env過表達(dá)極顯著（P<0.01）,JSRV-env重組慢病毒平均滴度為2.99×108...
【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報. 2020,25(07)北大核心CSCD
【文章頁數(shù)】：8 頁
【部分圖文】：
pCMV-dR8.91-JSRV-env重組載體構(gòu)建
將上述測序結(jié)果正確的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行質(zhì)粒抽提并測定濃度。5μg的pCMV-dR8.91-JSRV-env和10μg包裝輔助質(zhì)粒pCMV-VSV-G轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染72h后，在熒光顯微鏡下可觀察到在293T細(xì)胞中大量紅色熒光蛋白表達(dá)，提示JSRV-env重組慢病毒包裝成功（圖2）。2.3 純化的重組慢病毒滴度測定
本研究針對JSRV致癌基因env構(gòu)建過表達(dá)慢病毒并進(jìn)行體外NIH3T3細(xì)胞感染，為進(jìn)一步了解env致瘤機(jī)制提供新的研究方法。在前人的研究中，由于JSRV-env真核質(zhì)粒載體構(gòu)建流程簡單、試驗周期短，而成為過表達(dá)JSRV-env的主要工具[5-8]。但質(zhì)粒轉(zhuǎn)染存在許多缺陷：首先，JSRV-env質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染效率不穩(wěn)定，不同細(xì)胞在不同轉(zhuǎn)染方法和不用轉(zhuǎn)染介質(zhì)中，轉(zhuǎn)染效率差別大，且大部分細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率不高；其次，JSRV-env質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞核效率低，特別是陽離子脂質(zhì)體對細(xì)胞損傷較大[11]。與質(zhì)粒相比，病毒載體轉(zhuǎn)染效率高，可實現(xiàn)體外細(xì)胞的高效且穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)[12]。目前常用的兩種JSRV-env真核質(zhì)粒共2種：一種為帶HA標(biāo)簽的pcDNA3.1真核質(zhì)粒[13]；另一種為帶HIS標(biāo)簽的pcDNA4.0質(zhì)粒[9]。其中，pcDNA3.1質(zhì)粒需要插入SPA提高JSRV-env表達(dá)效率[13]，與JSRV-env質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，JSRV-env慢病毒載體感染細(xì)胞一方面可以過表達(dá)env；另一方面慢病毒的長末端重復(fù)序列（Long terminal repeats,LTRs）含有病毒啟動子和增強(qiáng)子元件能夠增強(qiáng)病毒的表達(dá)，極大地還原了病毒對細(xì)胞的作用條件，是目前JSRV-env過表達(dá)較為理想的載體[14]。圖4 不同載量JSRV-env重組慢病毒感染NIH3T3細(xì)胞
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]綿羊肺腺瘤病毒真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1（+）/exJSRV-env引起體內(nèi)和體外細(xì)胞發(fā)生的轉(zhuǎn)化[J]. 石晶,張宇飛,劉淑英. 中國獸醫(yī)學(xué)報. 2017(05)
[2]綿羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白的表達(dá)可促進(jìn)NIH3T3細(xì)胞增殖[J]. 杜方原,陳大勇,張宇飛,孫曉林,郭文慶,劉淑英. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志. 2016(09)
本文編號：3599922
【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報. 2020,25(07)北大核心CSCD
【文章頁數(shù)】：8 頁
【部分圖文】：
pCMV-dR8.91-JSRV-env重組載體構(gòu)建
將上述測序結(jié)果正確的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行質(zhì)粒抽提并測定濃度。5μg的pCMV-dR8.91-JSRV-env和10μg包裝輔助質(zhì)粒pCMV-VSV-G轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染72h后，在熒光顯微鏡下可觀察到在293T細(xì)胞中大量紅色熒光蛋白表達(dá)，提示JSRV-env重組慢病毒包裝成功（圖2）。2.3 純化的重組慢病毒滴度測定
本研究針對JSRV致癌基因env構(gòu)建過表達(dá)慢病毒并進(jìn)行體外NIH3T3細(xì)胞感染，為進(jìn)一步了解env致瘤機(jī)制提供新的研究方法。在前人的研究中，由于JSRV-env真核質(zhì)粒載體構(gòu)建流程簡單、試驗周期短，而成為過表達(dá)JSRV-env的主要工具[5-8]。但質(zhì)粒轉(zhuǎn)染存在許多缺陷：首先，JSRV-env質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染效率不穩(wěn)定，不同細(xì)胞在不同轉(zhuǎn)染方法和不用轉(zhuǎn)染介質(zhì)中，轉(zhuǎn)染效率差別大，且大部分細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率不高；其次，JSRV-env質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞核效率低，特別是陽離子脂質(zhì)體對細(xì)胞損傷較大[11]。與質(zhì)粒相比，病毒載體轉(zhuǎn)染效率高，可實現(xiàn)體外細(xì)胞的高效且穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)[12]。目前常用的兩種JSRV-env真核質(zhì)粒共2種：一種為帶HA標(biāo)簽的pcDNA3.1真核質(zhì)粒[13]；另一種為帶HIS標(biāo)簽的pcDNA4.0質(zhì)粒[9]。其中，pcDNA3.1質(zhì)粒需要插入SPA提高JSRV-env表達(dá)效率[13]，與JSRV-env質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，JSRV-env慢病毒載體感染細(xì)胞一方面可以過表達(dá)env；另一方面慢病毒的長末端重復(fù)序列（Long terminal repeats,LTRs）含有病毒啟動子和增強(qiáng)子元件能夠增強(qiáng)病毒的表達(dá)，極大地還原了病毒對細(xì)胞的作用條件，是目前JSRV-env過表達(dá)較為理想的載體[14]。圖4 不同載量JSRV-env重組慢病毒感染NIH3T3細(xì)胞
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]綿羊肺腺瘤病毒真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1（+）/exJSRV-env引起體內(nèi)和體外細(xì)胞發(fā)生的轉(zhuǎn)化[J]. 石晶,張宇飛,劉淑英. 中國獸醫(yī)學(xué)報. 2017(05)
[2]綿羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白的表達(dá)可促進(jìn)NIH3T3細(xì)胞增殖[J]. 杜方原,陳大勇,張宇飛,孫曉林,郭文慶,劉淑英. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志. 2016(09)
本文編號：3599922
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