為研究綿羊肺腺瘤病毒（Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV）囊膜蛋白（Envelope,env）對NIH3T3細胞（小鼠胚胎成纖維細胞）增殖的影響,構建pCMV-dR8.91-JSRV-env慢病毒過表達載體并感染NIH3T3細胞。將JSRV-env基因連接紅色熒光慢病毒報告載體pCMV-dR8.91,基因測序正確后將載體命名為pCMV-dR8.91-JSRV-env。將pCMV-dR8.91-JSRV-env重組質粒和包裝輔助質粒共轉染HEK 293T細胞包裝產生JSRV-env重組慢病毒。將重組慢病毒懸液利用超速離心沉淀法濃縮,real-time PCR測定病毒滴度。濃縮病毒轉導NIH3T3細胞72h后,噻唑藍（MTT）檢測細胞增殖情況。結果顯示:env同源重組入pCMV-dR8.91載體,測序結果與預期序列一致;pCMV-dR8.91-JSRV-env與包裝輔助質粒共轉染HEK 293T細胞72h,real-time PCR驗證JSRV-env過表達極顯著（P<0.01）,JSRV-env重組慢病毒平均滴度為2.99×10⁸... 

【文章來源】：中國農業(yè)大學學報. 2020,25(07)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

pCMV-dR8.91-JSRV-env重組載體構建

將上述測序結果正確的轉化子進行質粒抽提并測定濃度。5μg的pCMV-dR8.91-JSRV-env和10μg包裝輔助質粒pCMV-VSV-G轉染HEK293T細胞轉染72h后，在熒光顯微鏡下可觀察到在293T細胞中大量紅色熒光蛋白表達，提示JSRV-env重組慢病毒包裝成功（圖2）。2.3 純化的重組慢病毒滴度測定

本研究針對JSRV致癌基因env構建過表達慢病毒并進行體外NIH3T3細胞感染，為進一步了解env致瘤機制提供新的研究方法。在前人的研究中，由于JSRV-env真核質粒載體構建流程簡單、試驗周期短，而成為過表達JSRV-env的主要工具[5-8]。但質粒轉染存在許多缺陷：首先，JSRV-env質粒在細胞內轉染效率不穩(wěn)定，不同細胞在不同轉染方法和不用轉染介質中，轉染效率差別大，且大部分細胞轉染效率不高；其次，JSRV-env質粒轉染進入細胞核效率低，特別是陽離子脂質體對細胞損傷較大[11]。與質粒相比，病毒載體轉染效率高，可實現(xiàn)體外細胞的高效且穩(wěn)定轉導[12]。目前常用的兩種JSRV-env真核質粒共2種：一種為帶HA標簽的pcDNA3.1真核質粒[13]；另一種為帶HIS標簽的pcDNA4.0質粒[9]。其中，pcDNA3.1質粒需要插入SPA提高JSRV-env表達效率[13]，與JSRV-env質粒轉染細胞相比，JSRV-env慢病毒載體感染細胞一方面可以過表達env；另一方面慢病毒的長末端重復序列（Long terminal repeats,LTRs）含有病毒啟動子和增強子元件能夠增強病毒的表達，極大地還原了病毒對細胞的作用條件，是目前JSRV-env過表達較為理想的載體[14]。圖4 不同載量JSRV-env重組慢病毒感染NIH3T3細胞

【參考文獻】：
期刊論文
[1]綿羊肺腺瘤病毒真核表達質粒pcDNA3.1（+）/exJSRV-env引起體內和體外細胞發(fā)生的轉化[J]. 石晶,張宇飛,劉淑英.  中國獸醫(yī)學報. 2017(05)
[2]綿羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白的表達可促進NIH3T3細胞增殖[J]. 杜方原,陳大勇,張宇飛,孫曉林,郭文慶,劉淑英.  細胞與分子免疫學雜志. 2016(09)



本文編號：3599922