由sgRNA指導(dǎo)Cas9內(nèi)切酶從而特異性的識別基因位點并進行編輯的CRISPR/Cas9是近年興起的一項新技術(shù),相較于之前的鋅指核酸酶技術(shù)（Zinc finger nuclease, ZFNs）和轉(zhuǎn)錄激活子因子效應(yīng)物核酸酶技術(shù)（Transcription activator-like effector nucleases, TALENs）, CRISPR/Cas9在設(shè)計、使用方面更加簡便快捷,并且不需要對序列進行特殊分析,也不需要對應(yīng)地去尋找識別模塊,CRISPR/Cas更易于操作,效率更高,更容易得到純合子突變體,而且可以在不同的位點同時引入多個突變,其具有極大的應(yīng)用優(yōu)勢。本實驗是針對p一酪蛋白（β-casein, CSN2）的第二外顯子的一段序列設(shè)計并構(gòu)建了一組TALENs表達載體和一個CRISPR/Cas9表達載體。實驗選用了具有新霉素抗性基因（Neor）表達框架的質(zhì)粒為骨架,構(gòu)建了兩個針對TALENs. CRISPR/Cas9切割位點的同源打靶載體,分別為pFlrkt和pGlrkto其外源基因分別為人源化的Fat-1 （hFat-1）和EGFP,在CAGG啟動子上游包含長102... 

【文章來源】：內(nèi)蒙古大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數(shù)】：49 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
第一部分 實驗研究
    第一章 TALENs、CRISPR/Cas9以及打靶載體的構(gòu)建
        前言
        1 試劑和設(shè)備
            1.1 實驗試劑和材料
            1.2 儀器和設(shè)備
        2 方法
            2.1 TALENs載體的構(gòu)建
            2.2 CRISPR/Cas9載體的構(gòu)建
            2.3 pFlrkt打靶載體的構(gòu)建
            2.4 pGlrkt載體的構(gòu)建
        3 結(jié)果
            3.1 同源臂擴增結(jié)果
            3.2 載體構(gòu)建結(jié)果
            3.3 EGFP基因的擴增和pGlrkt載體的構(gòu)建結(jié)果
        4 討論
        5 小結(jié)
        參考文獻
    第二章 CRISPR/Cas9和TALENs介導(dǎo)的外源基因在奶山羊β-酪蛋白基因位點的整合
        前言
        1 試劑和設(shè)備
            1.1 實驗試劑和材料
            1.2 儀器設(shè)備
        2 方法
            2.1 打靶細胞的制備和篩選
            2.2 基因組的提取
            2.3 轉(zhuǎn)基因細胞的鑒定
        3 結(jié)果
            3.1 TALENs、CRISPR/Cas9分別與Glrkt共轉(zhuǎn)染后轉(zhuǎn)染效率的比較
            3.2 同源臂PCR鑒定結(jié)果
            3.3 打靶細胞的外源基因表達檢測
        4 討論
        5 小結(jié)
        參考文獻
    實驗結(jié)論
第二部分 文獻綜述 基因組編輯技術(shù)的研究進展
    前言
    1 ZFNs基因編輯技術(shù)
        1.1 ZFNs的結(jié)構(gòu)與工作原理
        1.2 ZFNs的構(gòu)建
        1.3 ZFNs技術(shù)的應(yīng)用
        1.4 ZFNs的優(yōu)勢和局限
    2 TALENs基因編輯技術(shù)
        2.1 TALENs的結(jié)構(gòu)和工作原理
        2.2 TALENs的構(gòu)建
        2.3 TALENs技術(shù)的應(yīng)用
        2.4 TALENs的優(yōu)勢和局限
    3 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)
        3.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和作用原理
        3.2 CRISPRs系統(tǒng)的構(gòu)建
        3.3 CRISPR/Cas9在基因編輯中的應(yīng)用
        3.4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的優(yōu)勢和局限
    4 展望
    參考文獻
致謝
攻讀學(xué)位期間申請的專利


【參考文獻】：
期刊論文
[1]Efficient and Specific Modifications of the Drosophila Genome by Means of an Easy TALEN Strategy[J]. Jiyong Liu~a,Changqing Li~a,Zhongsheng Yu~a,Peng Huang~b,Honggang Wu~a,Chuanxian Wei~a, Nannan Zhu~a,Yan Shen~b,Yixu Chen~a,Bo Zhang~b,Wu-Min Deng~(c,*),Renjie Jiao~(a,*) a State Key Laboratory of Brain and Cognitive Science,Institute of Biophysics,The Chinese Academy of Sciences,Datun Road 15,Beijing 100101,China b Key Laboratory of Cell Proliferation and Differentiation of Ministry of Education,College of Life Sciences,Peking University,Beijing 100871,China c Department of Biological Science,Florida State University,Tallahassee,Florida 32304-4295,USA.  遺傳學(xué)報. 2012(05)
[2]ω-3轉(zhuǎn)基因克隆綿羊誕生[J]. 段彪,程磊,蘇廣華,劉欣,胡曉明,劉坤,李俊龍,李光鵬.  內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版). 2011(01)
[3]秀麗隱桿線蟲fat-1基因密碼子優(yōu)化、克隆及家兔表達載體構(gòu)建[J]. 周紅梅,陳哲,蔡兆偉,蔣曉玲,徐寧迎,郭曉令.  江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué). 2010(06)
[4]羊奶的優(yōu)勢與發(fā)展前景[J]. 徐穎,汪璇,劉小丹,魏紅艷.  黑龍江畜牧獸醫(yī). 2010(14)
[5]Efficient production of omega-3 fatty acid desaturase （sFat-1）-transgenic pigs by somatic cell nuclear transfer[J]. PAN DengKe1, ZHANG Li1, ZHOU YanRong2, FENG Chong1, LONG Chuan1, LIU Xiao1, WAN Rong3, ZHANG Jian3, LIN AiXing3, DONG EnQiu4, WANG ShuChen4, XU HouGang4 & CHEN HongXing2 1 Institute of Animal Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China; 2 Beijing Institute of Biotechnology, Beijing 100071, China; 3 China Agricultural University, Beijing 100193, China; 4 Yutian Breeding Swine Farms, Yutian 064104, China.  Science China（Life Sciences）. 2010(04)
[6]羊奶對不同人群健康的影響[J]. 焦凌梅.  中國乳業(yè). 2008(05)
[7]C.elegans fat-1基因結(jié)構(gòu)、功能及其抗腫瘤機制的研究進展[J]. 劉曉蕾,葛銀林,蔣正堯.  醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志. 2006(02)
[8]山羊β酪蛋白基因克隆及序列分析[J]. 王強,陳美玨,任兆瑞,黃淑幀,曾溢滔.  中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報. 2003(01)
[9]中國白酒的溶膠特性及其應(yīng)用原理與方法[J]. 莊名揚.  釀酒. 2002(01)

博士論文
[1]ZFNs介導(dǎo)的牛MSTN位點的基因打靶研究[D]. 趙宇航.內(nèi)蒙古大學(xué) 2014
[2]花鱸肌肉生長抑素基因（MSTN）克隆、表達及其基因打靶載體的構(gòu)建[D]. 葉寒青.中國海洋大學(xué) 2006



本文編號：3599833