報告型重組寨卡病毒的構(gòu)建及在抗病毒藥物篩選中的應(yīng)用
發(fā)布時間：2022-01-08 11:14
寨卡病毒（Zika virus,ZIKV）是一種重要蚊媒傳播的人獸共患病病原,人、靈長類以及兔和豬對其易感,其感染宿主后能引起寨卡熱,大多數(shù)感染者并沒有明顯癥狀或者癥狀較為輕微,但若在妊娠期間發(fā)生ZIKV感染,則可能導(dǎo)致新生兒出生缺陷,同時還可能造成妊娠者發(fā)生流產(chǎn)和早產(chǎn)等嚴(yán)重癥狀。目前,ZIKV在全球范圍內(nèi)呈蔓延趨勢,我國雖無相關(guān)重大疫情的報道,但有相關(guān)研究顯示,新生仔豬對于ZIKV易感,這使我國生豬養(yǎng)殖業(yè)面臨著重大經(jīng)濟(jì)損失的風(fēng)險。ZIKV在全球范圍內(nèi)尚無特異性治療藥物,亦無人用ZIKV疫苗,因此,開展ZIKV相關(guān)防控研究迫在眉睫。本研究根據(jù)GenBank公布的ZIKV（FSS13025株）基因編碼序列以及密碼子優(yōu)化技術(shù),將ZIKV C、prM和E蛋白基因分別克隆到pMAL-c5x載體中,構(gòu)建pMAL-c5x-ZIKV-C、pMAL-c5x-ZIKV-prM和pMAL-c5x-ZIKV-E原核表達(dá)質(zhì)粒。將上述三種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至E.coli ER2523感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600為0.60.8時,加入終濃度為1.0 mM IPTG后繼續(xù)...
【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市
【文章頁數(shù)】：68 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
ZIKV的基因組結(jié)構(gòu)蛋白及多聚蛋白加工示意圖(Kopsidaetal.,2017)
子元件(Foecking and Hofstetter, 1986; Thomsen et al., 1984)，其在真核細(xì)胞中通過直接轉(zhuǎn)染病毒全長 cDNA 后便可以產(chǎn)生病毒 RNA。Pierson 等已成功將其用于 WNV 的“感染性 DNA”的構(gòu)建(Pierson et al., 2005)。通過反向遺傳技術(shù)來構(gòu)建 ZIKV 主要有以下三種策略：（1）轉(zhuǎn)染感染性 RNA 于易感細(xì)胞（ZIKV 全長基因組 cDNA 的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物）；（2）直接轉(zhuǎn)染 DNA 質(zhì)粒于易感細(xì)胞產(chǎn)生感染性 ZIKV；（3）將所有 ZIKV cDNA 片段共轉(zhuǎn)染到易感細(xì)胞中，然后利用同源重組方式在轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)通過自組裝全長 ZIKV cDNA 以拯救完整病毒(Avila-Perez et al., 2018)�；诤嗣傅淖晕壹羟胁呗�，Zhong-Yu Liu 等克隆了其實驗室于 2016 年分離的 ZIKV 的 cDNA 片段并成功組裝了全長 cDNA，該 ZIKV cDNA 在 E 和 NS1 基因之間的連接處附近插入具有修飾作用的 II 組自剪接內(nèi)含子P.li.LSUI2，其主要作用為保證 ZIKV cDNA 的穩(wěn)定性并且可通過體外剪接反應(yīng)從 RNA 轉(zhuǎn)錄物中除去，該 ZIKV cDNA 克隆轉(zhuǎn)錄的 RNA 產(chǎn)物轉(zhuǎn)染到 BHK-21 細(xì)胞中能夠產(chǎn)生感染性子代病毒(Liuet al., 2017)。James Weger-Lucarelli 等利用第二種策略構(gòu)建了兩種質(zhì)粒感染性克隆系統(tǒng)，并拯救了能在人和蚊子細(xì)胞中復(fù)制的感染性病毒(Weger-Lucarelli et al., 2017)。Gadea 等開發(fā)了一種可以快速構(gòu)建報告型 ZIKV 的克隆方法：將 eGFP 基因插入到 ZIKV C 蛋白 N 端第 33 個氨基酸后，同時在引入四個重疊的全長基因組 RNA 序列的重疊合成片段，將病毒 RNA 基因組直接電轉(zhuǎn)到 Vero細(xì)胞中，這種策略能夠產(chǎn)生表達(dá) GFP 報告基因的重組 ZIKV（圖 1-2）(Gadea et al., 2016)。
國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 寨卡病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因的原核表達(dá)及多克隆抗體的制12~16 h后，按1:100比例接種于100 ml LB培養(yǎng)基中至OD600為0.6～0.8，加入終濃度為1.0 mPTG 后繼續(xù)震蕩培養(yǎng) 4 h。將誘導(dǎo)菌液離心經(jīng)超聲破碎后，分別取上清和沉淀進(jìn)行 SDS-PAGE鑒定 ZIKV C、prM 和 E 結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：誘導(dǎo)表達(dá)的 ZIKV C、prM 和 E 結(jié)白與未誘導(dǎo)菌株相比較發(fā)現(xiàn)其分別在 55 kDa，60 kDa 和 100 kDa 大小左右出現(xiàn)粗狀目的條帶明 ZIKV C、prM 和 E 基因蛋白能夠準(zhǔn)確表達(dá)，與預(yù)期一致（圖 2-2）。
本文編號：3576454
【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市
【文章頁數(shù)】：68 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
ZIKV的基因組結(jié)構(gòu)蛋白及多聚蛋白加工示意圖(Kopsidaetal.,2017)
子元件(Foecking and Hofstetter, 1986; Thomsen et al., 1984)，其在真核細(xì)胞中通過直接轉(zhuǎn)染病毒全長 cDNA 后便可以產(chǎn)生病毒 RNA。Pierson 等已成功將其用于 WNV 的“感染性 DNA”的構(gòu)建(Pierson et al., 2005)。通過反向遺傳技術(shù)來構(gòu)建 ZIKV 主要有以下三種策略：（1）轉(zhuǎn)染感染性 RNA 于易感細(xì)胞（ZIKV 全長基因組 cDNA 的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物）；（2）直接轉(zhuǎn)染 DNA 質(zhì)粒于易感細(xì)胞產(chǎn)生感染性 ZIKV；（3）將所有 ZIKV cDNA 片段共轉(zhuǎn)染到易感細(xì)胞中，然后利用同源重組方式在轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)通過自組裝全長 ZIKV cDNA 以拯救完整病毒(Avila-Perez et al., 2018)�；诤嗣傅淖晕壹羟胁呗�，Zhong-Yu Liu 等克隆了其實驗室于 2016 年分離的 ZIKV 的 cDNA 片段并成功組裝了全長 cDNA，該 ZIKV cDNA 在 E 和 NS1 基因之間的連接處附近插入具有修飾作用的 II 組自剪接內(nèi)含子P.li.LSUI2，其主要作用為保證 ZIKV cDNA 的穩(wěn)定性并且可通過體外剪接反應(yīng)從 RNA 轉(zhuǎn)錄物中除去，該 ZIKV cDNA 克隆轉(zhuǎn)錄的 RNA 產(chǎn)物轉(zhuǎn)染到 BHK-21 細(xì)胞中能夠產(chǎn)生感染性子代病毒(Liuet al., 2017)。James Weger-Lucarelli 等利用第二種策略構(gòu)建了兩種質(zhì)粒感染性克隆系統(tǒng)，并拯救了能在人和蚊子細(xì)胞中復(fù)制的感染性病毒(Weger-Lucarelli et al., 2017)。Gadea 等開發(fā)了一種可以快速構(gòu)建報告型 ZIKV 的克隆方法：將 eGFP 基因插入到 ZIKV C 蛋白 N 端第 33 個氨基酸后，同時在引入四個重疊的全長基因組 RNA 序列的重疊合成片段，將病毒 RNA 基因組直接電轉(zhuǎn)到 Vero細(xì)胞中，這種策略能夠產(chǎn)生表達(dá) GFP 報告基因的重組 ZIKV（圖 1-2）(Gadea et al., 2016)。
國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 寨卡病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因的原核表達(dá)及多克隆抗體的制12~16 h后，按1:100比例接種于100 ml LB培養(yǎng)基中至OD600為0.6～0.8，加入終濃度為1.0 mPTG 后繼續(xù)震蕩培養(yǎng) 4 h。將誘導(dǎo)菌液離心經(jīng)超聲破碎后，分別取上清和沉淀進(jìn)行 SDS-PAGE鑒定 ZIKV C、prM 和 E 結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：誘導(dǎo)表達(dá)的 ZIKV C、prM 和 E 結(jié)白與未誘導(dǎo)菌株相比較發(fā)現(xiàn)其分別在 55 kDa，60 kDa 和 100 kDa 大小左右出現(xiàn)粗狀目的條帶明 ZIKV C、prM 和 E 基因蛋白能夠準(zhǔn)確表達(dá)，與預(yù)期一致（圖 2-2）。
本文編號：3576454
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