東方巴貝斯蟲（Babesia orientalis）是寄生于水牛的一種重要的血液原蟲,以鐮形扇頭蜱（Rhipicephalus haemaphysaloides）為傳播媒介,臨床癥狀為高熱、貧血、黃疸和血紅蛋白尿等,嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致水牛死亡。東方巴貝斯蟲病在我國(guó)南方許多省份發(fā)生和流行,造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)危害。本實(shí)驗(yàn)室通過對(duì)東方巴貝斯蟲的形態(tài)學(xué)、生活史、傳播媒介和分子分類學(xué)等多方面詳細(xì)研究,確立B. orientalis為一新種。近年來,本實(shí)驗(yàn)室致力于B.orientalis分子生物學(xué)研究,對(duì)東方巴貝斯蟲進(jìn)行了全基因組測(cè)序,為研究B.orientalis的功能基因提供了重要途徑。小分子熱休克蛋白（small heat shock proteins, sHSPs）是分子量大小在12-43kDa,具有保守的約80～100氨基酸組成的α晶狀體蛋白結(jié)構(gòu)域的一類熱休克蛋白亞家族。sHSPs與寄生蟲感染具有重要的關(guān)系,其中小分子熱休克蛋白HSP20影響頂復(fù)門寄生蟲的移行和入侵等過程。巴貝斯蟲的HSP20蛋白非常保守,是一種重要的蟲體抗原,能夠引起特異性T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。本研究通過比對(duì)基因組信息,找出東方巴貝斯蟲... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：70 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 研究背景
    1.2 小分子熱休克蛋白研究進(jìn)展
        1.2.1 小分子熱休克蛋白的概述
        1.2.2 小分子熱休克蛋白的生物學(xué)作用
        1.2.3 小分子熱休克蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及與功能的關(guān)系
        1.2.4 小分子熱休克蛋白與寄生蟲感染
2 研究目的與意義
3 材料與方法
    3.1 試驗(yàn)材料
        3.1.1 蟲株、血清和試驗(yàn)動(dòng)物
        3.1.2 質(zhì)粒和菌株
        3.1.3 酶和主要試劑
        3.1.4 抗生素和培養(yǎng)基的配制
        3.1.5 主要溶液的配制
        3.1.6 儀器和設(shè)備
    3.2 試驗(yàn)方法
        3.2.1 生物信息學(xué)分析方法和工具
        3.2.2 引物的設(shè)計(jì)
        3.2.3 東方巴貝斯蟲基因組DNA的提取
        3.2.4 東方巴貝斯蟲HSP20基因的擴(kuò)增和克隆測(cè)序
        3.2.5 系統(tǒng)進(jìn)化分析
        3.2.6 東方巴貝斯蟲總RNA的提取
        3.2.7 RT-PCR擴(kuò)增東方巴貝斯蟲HSP20基因的ORF
        3.2.8 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.2.9 東方巴貝斯蟲HSP20蛋白表達(dá)
        3.2.10 表達(dá)產(chǎn)物的大量提取和純化
        3.2.11 Western blot試驗(yàn)
        3.2.12 ELISA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)牛血清抗體水平
        3.2.13 多抗血清的制備和間接免疫熒光試驗(yàn)
        3.2.14 大腸桿菌存活率實(shí)驗(yàn)
        3.2.15 HSP20蛋白對(duì)BSA化學(xué)變性保護(hù)作用的測(cè)定
4 結(jié)果與分析
    4.1 東方巴貝斯蟲HSP20基因的克隆及分析
        4.1.1 HSP20基因的PCR擴(kuò)增
        4.1.2 HSP20基因序列的測(cè)定
        4.1.3 HSP20基因內(nèi)含子的確定
        4.1.4 HSP20序列的比對(duì)和分子進(jìn)化分析
        4.1.5 HSP20序列的生物信息學(xué)分析
    4.2 東方巴貝斯蟲HSP20蛋白的表達(dá)、純化及抗原性
        4.2.1 HSP20基因ORF的擴(kuò)增
        4.2.2 重組質(zhì)粒pMD19-T-BoHSP20的構(gòu)建和酶切鑒定
        4.2.3 重組質(zhì)粒pET-28a-BoHSP20的構(gòu)建和酶切鑒定
        4.2.4 HSP20蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
        4.2.5 表達(dá)產(chǎn)物存在形式
        4.2.6 表達(dá)條件的優(yōu)化
        4.2.7 HSP20蛋白的純化及抗原性分析
    4.3 東方巴貝斯蟲HSP20的免疫原性分析
        4.3.1 東方巴貝斯蟲的免疫熒光定位
        4.3.2 牛血清抗體水平檢測(cè)
    4.4 東方巴貝斯蟲HSP20分子伴侶活性檢測(cè)
        4.4.1 HSP20的表達(dá)對(duì)大腸桿菌存活率的影響
        4.4.2 HSP20對(duì)BSA化學(xué)變性的保護(hù)作用
5 討論
    5.1 東方巴貝斯蟲HSP20基因克隆及序列分析
    5.2 東方巴貝斯蟲HSP20蛋白的表達(dá)和功能驗(yàn)證
6 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]新疆牛雙芽巴貝斯蟲病的流行病學(xué)調(diào)查[J]. 簡(jiǎn)子健,馬素貞,孫其喆,沈炯玉,呂偉,苗中秋.  中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2012(02)
[2]牛雙芽巴貝斯蟲GST-HSP20（exon）融合蛋白間接ELISA檢測(cè)方法的建立[J]. 簡(jiǎn)子健,馬素貞,孫其喆,沈炯玉,苗中秋,呂偉.  新疆農(nóng)業(yè)科學(xué). 2010(05)
[3]東方巴貝斯蟲分泌性抗原的免疫保護(hù)作用研究[J]. 趙俊龍,劉鐘靈,姚寶安,馬麗華,劉恩勇,丁明星,張德明,任憲武,彭伏虎,鐘龍群.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2000(02)
[4]巴貝斯蟲病水牛血清鈣鎂濃度變化與染蟲率的關(guān)系[J]. 趙俊龍,尹緒軍,劉鐘靈.  中國(guó)動(dòng)物檢疫. 1997(04)
[5]寄生于中國(guó)水牛Bubalus　Vbubalis的巴貝斯蟲一新種（梨形蟲目:巴貝斯科）[J]. 劉鐘靈,趙俊龍,馬麗華,姚寶安.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 1997(01)
[6]巴貝斯蟲及其傳播媒介——蜱的研究概況[J]. 陳啟軍,李德昌.  黑龍江畜牧獸醫(yī). 1995(11)
[7]應(yīng)用鐮形扇頭蜱及巴貝斯蟲病水牛的染蟲血感染黃牛試驗(yàn)[J]. 劉鐘靈,馬麗華,姚寶安,趙俊龍.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 1995(05)
[8]水牛牛巴貝斯蟲體外培養(yǎng)的研究Ⅱ．冷凍血清的應(yīng)用和篩選[J]. 趙俊龍,姚寶安,馬麗華,劉鐘靈.  中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào). 1994(02)
[9]湖北省水牛巴貝斯焦蟲病調(diào)查研究[J]. 劉鐘靈,張光第,馬麗華,黃繼蓀,陳新階,高新山,楊待建.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 1986(01)

博士論文
[1]東方巴貝斯蟲新型診斷方法的建立和基因組序列測(cè)定與分析[D]. 賀蘭.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011
[2]東方巴貝斯蟲免疫相關(guān)蛋白的基因克隆及功能研究[D]. 周丹娜.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2009
[3]東方巴貝斯蟲cDNA文庫構(gòu)建及其應(yīng)用[D]. 劉琴.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2007

碩士論文
[1]牛雙芽巴貝斯蟲HSP20基因的克隆表達(dá)及其重組蛋白的免疫反應(yīng)性研究[D]. 孫其喆.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 2009



本文編號(hào)：3576427