OCT4轉(zhuǎn)錄因子在維持和調(diào)控胚胎干細(xì)胞的多能性中發(fā)揮著重要的作用。OCT4基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)標(biāo)志蛋白的表達(dá)對(duì)胚胎干細(xì)胞多能性研究和iPS的建立有重要的意義。由于綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein, GFP）在慢病毒轉(zhuǎn)染過(guò)程中常用作轉(zhuǎn)染標(biāo)記,因此構(gòu)建兔OCT4基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)紅色熒光蛋白（Red fluorescent protein, RFP）的表達(dá),將有利于兔iPS制備的研究。本研究通過(guò)PCR方法克隆了兔的OCT4啟動(dòng)子（rOCT4）,構(gòu)建了rOCT4驅(qū)動(dòng)RFP的表達(dá)載體rOCT4-RFP,經(jīng)轉(zhuǎn)染小鼠ES細(xì)胞驗(yàn)證正確后,將rOCT4-RFP轉(zhuǎn)染兔成纖維細(xì)胞系獲得兔rOCT4-RFP成纖維細(xì)胞。結(jié)果：經(jīng)過(guò)酶切和測(cè)序驗(yàn)證,證明rOCT4-RFP構(gòu)建成功,而且能夠在小鼠ES細(xì)胞系E14中表達(dá)細(xì)胞紅色熒光蛋白,而分化后的rOCT4-RFP轉(zhuǎn)基因E14細(xì)胞不表達(dá)紅色熒光蛋白。通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、抗性篩選和PCR鑒定建立了rOCT4-RFP轉(zhuǎn)基因成纖維細(xì)胞系。OCT4啟動(dòng)子的甲基化與干細(xì)胞的多能性有關(guān),為將來(lái)研究OCT4啟動(dòng)子的甲基化與細(xì)胞的狀態(tài)變化,擬建立甲基化的... 

【文章來(lái)源】：東北林業(yè)大學(xué)黑龍江省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：54 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 緒論
    1.1 胚胎干細(xì)胞的研究
        1.1.1 胚胎十細(xì)胞
        1.1.2 ES細(xì)胞的研究進(jìn)展
    1.2 現(xiàn)代動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究概況
        1.2.1 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究技術(shù)手段及歷程
        1.2.2 轉(zhuǎn)基因兔的應(yīng)用及進(jìn)展
    1.3 OCT4多能性的研究概況
    1.4 DNA甲基化的研究概況
    1.5 本研究的課題設(shè)計(jì)
        1.5.1 OCT4的全能性
        1.5.2 建立DNA甲基化-CMV啟動(dòng)子甲基化技術(shù)平臺(tái)
2 實(shí)驗(yàn)方法和步驟
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.1.2 主要材料與試劑
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 培養(yǎng)液的配制
    2.2 實(shí)驗(yàn)操作方法
        2.2.1 PCR
        2.2.2 瓊脂糖核酸電泳
        2.2.3 膠回收純化DNA
        2.2.4 酶切
        2.2.5 連接
        2.2.6 轉(zhuǎn)化
        2.2.7 重組子的抽提、篩選和鑒定
        2.2.8 ES細(xì)胞轉(zhuǎn)染、挑克隆、傳代、復(fù)蘇細(xì)胞、凍存細(xì)胞的方法
    2.3 質(zhì)粒的構(gòu)建方法
        2.3.1 引物的設(shè)計(jì)
        2.3.2 CMVRFP-C1的設(shè)計(jì)和構(gòu)建
        2.3.3 rOct4-RFP質(zhì)粒得設(shè)計(jì)和構(gòu)建
    2.4 表達(dá)載體的驗(yàn)證
        2.4.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和篩選建系
        2.4.2 誘導(dǎo)rOCT4-RFP轉(zhuǎn)基因E14細(xì)胞體外分化
        2.4.3 rOCT4-RFP轉(zhuǎn)染雄性兔體細(xì)胞
        2.4.4 轉(zhuǎn)基因成纖維細(xì)胞PCR鑒定
    2.5 DNA甲基化-CMV啟動(dòng)子甲基化實(shí)驗(yàn)方法
        2.5.1 DNA甲基化檢測(cè)——亞硫酸鹽修飾后測(cè)序法
        2.5.2 成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)及DNA的提取
        2.5.3 亞硫酸修飾方法步驟
        2.5.4 修飾后DNA回收方法步驟
        2.5.5 甲基化的檢測(cè)步驟
3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    3.1 質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定
        3.1.1 CMV-RFP-C1質(zhì)粒和rOct4-RFP質(zhì)粒的構(gòu)建
    3.2 胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)染鑒定
    3.3 誘導(dǎo)rOCT4-RFP轉(zhuǎn)基因E14細(xì)胞體外分化
    3.4 rOCT4-RFP轉(zhuǎn)染兔成纖維細(xì)胞及鑒定
    3.5 甲基化檢測(cè)結(jié)果
4 討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]兔Oct4啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)RFP基因表達(dá)載體的構(gòu)建及驗(yàn)證[J]. 唐瀾,姜偉華,尹明茹,周小梅,李和平,陳學(xué)進(jìn),李善剛.  中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào). 2014(01)
[2]小鼠胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化[J]. 陳天姬,杜娟,盧光琇.  西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2010(12)
[3]異源Oct-4基因啟動(dòng)子在豬、兔和小鼠早期胚胎中的時(shí)空表達(dá)活性[J]. 張穎,史芳瑜,高紹榮,林愛星.  生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展. 2009(09)
[4]DNA甲基轉(zhuǎn)移酶分類、功能及其研究進(jìn)展[J]. 王志剛,吳建新.  遺傳. 2009(09)
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