旨在利用同源重組構(gòu)建敖漢細(xì)毛羊Hoxa5、BMP6基因表達(dá)載體及共轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞后通過(guò)基因表達(dá)量變化研究?jī)苫蛑g的相互作用關(guān)系。以敖漢細(xì)毛羊?yàn)檠芯繉?duì)象,采集30日齡的胎羊。首先,通過(guò)RNA的提取反轉(zhuǎn)錄成cDNA參照GenBank中Hoxa5、BMP6基因序列和pcDNA3.1序列分別設(shè)計(jì)1對(duì)含有同源臂的引物,通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增獲得Hoxa5、BMP6基因片段、利用SoSo試劑盒將目的片段連接到pcDNA3.1真核表達(dá)載體上。鑒定構(gòu)建pcDNA3.1-Hoxa5、pcDNA3.1-BMP6重組表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞;其次對(duì)敖漢細(xì)毛羊的成纖維細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng),并將構(gòu)建的質(zhì)粒pcDNA3.1-Hoxa5、pcDNA3.1-BMP6共轉(zhuǎn)染至成纖維細(xì)胞,采用RT-PCR技術(shù)和Western Blot技術(shù)檢測(cè)Hoxa5、BMP6基因單轉(zhuǎn)染和共轉(zhuǎn)染在成纖維細(xì)胞中表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示:經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定質(zhì)粒pcDNA3.1-Hoxa5、pcDNA3.1-BMP6構(gòu)建成功,并且共轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞Hoxa5基因的表達(dá)量極顯著下降,BMP6基因的表達(dá)量極顯著升高且共轉(zhuǎn)染組的表達(dá)量極顯著地高... 

【文章來(lái)源】：華北農(nóng)學(xué)報(bào). 2020,35(04)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

Hoxa5、BMP6基因 PCR擴(kuò)增

使用Kpn Ⅰ將pcDNA3.1表達(dá)載體從環(huán)狀酶切成鏈狀,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是否酶切成功(圖2)。1,2是對(duì)pcDNA3.1的Kpn Ⅰ單酶切,pcDNA3.1長(zhǎng)度為5 428 bp,圖中條帶所在位置約是5 428 bp,結(jié)果顯示酶切完成,回收條帶進(jìn)行重組。2.3 pcDNA3.1表達(dá)載體的重組及鑒定

將pcDNA3.1酶切成鏈狀后,用SoSo試劑盒將BMP6、Hoxa5分別與pcDNA3.1相連接,轉(zhuǎn)化,振蕩培養(yǎng),進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證如圖3所示,在約804 bp處有明亮電泳條帶,是Hoxa5基因;537 bp處的是BMP6基因。菌液測(cè)序結(jié)果用Blast進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果如圖4,說(shuō)明BMP6、Hoxa5沒(méi)有堿基的突變,已成功的連接到pcDNA3.1載體上。將連接好的重組載體從菌液中提取出來(lái),如圖5所示,1-2為pcDNA3.1-BMP6重組質(zhì)粒,大小為5 965 bp,3-4為pcDNA3.1-Hoxa5重組質(zhì)粒,大小為6 232 bp,與圖中條帶相符。2.4 細(xì)胞培養(yǎng)觀察

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]敖漢細(xì)毛羊BMP4基因質(zhì)粒的構(gòu)建及在成纖維細(xì)胞中表達(dá)量的研究[J]. 張夢(mèng)瑤,楊峰,劉開(kāi)東,劉積鳳,柳楠,賀建寧,薛明.  華北農(nóng)學(xué)報(bào). 2019(06)
[2]敖漢細(xì)毛羊Hoxa5、BMPR1B基因互作研究[J]. 張夢(mèng)瑤,楊峰,劉積鳳,劉開(kāi)東,賀建寧,柳楠.  華北農(nóng)學(xué)報(bào). 2019(02)
[3]敖漢細(xì)毛羊Notch1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及在成纖維細(xì)胞中表達(dá)量的研究[J]. 趙然然,張夢(mèng)瑤,劉開(kāi)東,王國(guó)義,劉積鳳,柳楠,賀建寧.  畜牧與獸醫(yī). 2019(03)
[4]利用同源重組技術(shù)構(gòu)建DKK1、BMP4真核表達(dá)載體及共轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞表達(dá)的研究[J]. 張夢(mèng)瑤,楊峰,劉開(kāi)東,劉積鳳,賀建寧,柳楠.  華北農(nóng)學(xué)報(bào). 2018(05)
[5]敖漢細(xì)毛羊Hoxa5基因質(zhì)粒的構(gòu)建及在成纖維細(xì)胞中表達(dá)量的研究[J]. 張夢(mèng)瑤,楊峰,劉開(kāi)東,劉積鳳,柳楠,賀建寧.  中國(guó)獸醫(yī)雜志. 2018(10)
[6]利用同源重組構(gòu)建敖漢細(xì)毛羊BMPR1B真核表達(dá)載體及在成纖維細(xì)胞中表達(dá)量的研究[J]. 張夢(mèng)瑤,楊峰,劉開(kāi)東,劉積鳳,柳楠,賀建寧.  中國(guó)畜牧雜志. 2018(09)
[7]利用同源重組構(gòu)建BMP6基因真核表達(dá)載體及在成纖維細(xì)胞中表達(dá)量的研究[J]. 張夢(mèng)瑤,楊峰,劉開(kāi)東,劉積鳳,柳楠,賀建寧.  中國(guó)畜牧雜志. 2018(08)
[8]敖漢細(xì)毛羊DKK1基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其在成纖維細(xì)胞中表達(dá)量的研究[J]. 張夢(mèng)瑤,楊峰,劉開(kāi)東,程明,王國(guó)義,劉積鳳,柳楠,賀建寧.  中國(guó)畜牧獸醫(yī). 2018(01)
[9]鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白、骨形成蛋白6及鐵調(diào)素在乳腺癌組織中的表達(dá)及其與貧血的關(guān)系[J]. 程旭,陸曄,李蓉,嚴(yán)敏,潘湘濤.  醫(yī)學(xué)研究雜志. 2017(11)
[10]BMP6基因在單、雙羔蒙古羊不同生理時(shí)期卵巢組織中的差異表達(dá)及分析[J]. 楊燕燕,杜文,劉永斌,達(dá)來(lái),王標(biāo),青格勒,周璇,何亭漪,烏達(dá)巴拉,田瑛.  畜牧與飼料科學(xué). 2017(03)



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