作為α皰疹病毒的重要成員,馬立克病病毒（MDV）感染雞可引起免疫抑制及快速發(fā)作的T細胞淋巴瘤,即馬立克�。∕D）。此前發(fā)現(xiàn)MDV基因組編碼大量病毒miRNA,可能在病毒復制、潛伏感染及腫瘤發(fā)生中起重要作用�；蚯贸齧iR-M11-5p可顯著增強MDV致病性及致瘤性,表明其可能是MD腫瘤抑制因子。為進一步揭示miR-M11-5p介導的調(diào)控機制,本研究利用雞胚成纖維細胞（CEF）總RNA的cDNA為模板,通過hybrid-PCR擴增miR-M11-5p的候選宿主靶基因片段,然后連接至pMD19-T載體、轉(zhuǎn)化至E.coli JM109中構(gòu)建cDNA文庫。對文庫菌落進行PCR鑒定、測序分析以及Blast序列對比,共獲得77個候選宿主靶基因,其中37個miRNA結(jié)合靶點位于候選靶基因的3′-UTR中。進一步通過雙熒光素酶報告試驗、miR-M11-5p過表達以及RT-qPCR分析,最終鑒定雞MAFB、LOC776816和RFX7為miR-M11-5p的宿主靶基因。本研究為進一步闡明miR-M11-5p在MDV腫瘤發(fā)生中的調(diào)控機制奠定了重要基礎(chǔ)。 

【文章來源】：畜牧獸醫(yī)學報. 2019,50(05)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：13 頁

【部分圖文】：

圖１ｈｙｂｒｉｄ－ＰＣＲ產(chǎn)物凝膠電泳分析Ｍ．ＤＬ２０００ＤＮＡ相對分子質(zhì)量標準Ｍ．ＤＬ２０００ＤＮＡｍａｒｋｅｒ

５期劉豪麗等：馬立克病病毒編碼的ｍｉＲ－Ｍ１１－５ｐ宿主靶基因的篩選與鑒定誤差線代表三次獨立的重復試驗；＊．差異性顯著（Ｐ＜０．０５）Ｅｒｒｏｒｂａｒｓａｒｅｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｔｈｒｅｅｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ．＊．Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＜０．０５）圖５ＲＴ－ｑＰＣＲ分析ｍｄｖ１－ｍｉＲ－Ｍ１１－５ｐ過表達ＣＥＦ細胞中的靶基因ｍＲＮＡ水平Ｆｉｇ．５ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｔａｒｇｅｔｍＲＮＡｇｅｎｅｓｉｎｍｉＲ－Ｍ１１－５ｐｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｅｄＣＥＦｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙＲＴ－ｑＰＣＲ族的成員。有研究表明，轉(zhuǎn)錄因子ＲＦＸ７可限制自然殺傷（ＮＫ）細胞的代謝并促進其維持和免疫，ＲＦＸ７的缺失可導致ＮＫ細胞維持和體內(nèi)免疫力的降低［２２］。ｍｉＲ－Ｍ１１－５ｐ靶向并抑制ＲＦＸ７基因表達，可能在ＭＤ腫瘤發(fā)生過程中細胞吞噬、免疫力發(fā)揮重要的負調(diào)控作用。綜上所述，本研究的數(shù)據(jù)進一步佐證了筆者之前對ｍｉＲ－Ｍ１１－５ｐ是ＭＤ腫瘤抑制因子的推測，但其抑癌的分子機制仍有待進一步的深入研究。４結(jié)論通過ｈｙｂｒｉｄ－ＰＣＲ構(gòu)建了ｍｉＲ－Ｍ１１－５ｐ的候選靶基因ｃＤＮＡ文庫。通過基因克隆和測序分析，從文庫中初步獲得７７個候選宿主靶基因，其中３７個ｍｉＲＮＡ結(jié)合位點位于ｍＲＮＡ基因３′－ＵＴＲ中。通過雙熒光素酶報告試驗、ｍｉＲＮＡ過表達及ＲＴ－ｑＰＣＲ分析，最終鑒定ＭＡＦＢ、ＲＦＸ７和Ｌ

【參考文獻】：
期刊論文
[1]Transcriptional factors, Mafs and their biological roles[J]. Mariko Tsuchiya,Ryoichi Misaka,Kosaku Nitta,Ken Tsuchiya.  World Journal of Diabetes. 2015(01)
[2]馬立克氏病病毒編碼的microRNA:從基因組學到功能研究[J]. 羅俊,滕蔓,樊劍鳴,王方雨,周玲,鄧瑞廣,張改平.  中國科學:生命科學. 2010(06)

博士論文
[1]Mid基因簇miRNAs在馬立克病病毒致病中的潛在功能研究[D]. 滕蔓.甘肅農(nóng)業(yè)大學 2017
[2]馬立克氏病病毒miRNA的體內(nèi)動態(tài)表達譜及對病毒基因的自我調(diào)控[D]. 趙樸.西北農(nóng)林科技大學 2016



本文編號：3555167