為了研究緊密連接蛋白Occludin（OCLN）在調(diào)控牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus,BVDV）胞內(nèi)復(fù)制中的重要作用。使用Benchling平臺設(shè)計(jì)OCLN的向?qū)NA（short guide RNA,sgRNA）序列,克隆至LentiCRISPR V2質(zhì)粒中,包裝慢病毒后感染牛腎細(xì)胞（madin-darby bovine kidney,MDBK）,使用嘌呤霉素進(jìn)行陽性細(xì)胞篩選,使用Western blot檢測OCLN敲除情況,建立OCLN敲除MDBK細(xì)胞系;于BVDV感染OCLN KO細(xì)胞不同時(shí)間,使用熒光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）和免疫熒光染色（immunofluorescence,IF）檢測BVDV 5’非編碼區(qū)（untranslated region,UTR）mRNA和雙鏈RNA（double strand RNA,dsRNA）水平;使用Reed-Muench法測定BVDV感染OCLN KO細(xì)胞不同時(shí)間后病毒滴度;使用倒置顯微鏡觀察BVD... 

【文章來源】：中國獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2020,40(11)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：8 頁

【部分圖文】：

酶切LentiCRISPR v2載體

共同轉(zhuǎn)染慢病毒質(zhì)粒及包裝輔助質(zhì)粒后收集慢病毒,感染靶細(xì)胞后使用嘌呤霉素進(jìn)行篩選,獲得陽性細(xì)胞。plenti-GFP-N2慢病毒作為熒光陽性對照,如圖2所示,plenti-GFP-N2慢病毒感染MDBK,使用嘌呤霉素篩選5代后,熒光細(xì)胞密度達(dá)90%以上,表明慢病毒感染性較好,其方法可用于其他慢病毒的包裝、感染和陽性細(xì)胞篩選。2.3 Western blot鑒定OCLN KO細(xì)胞

于BVDV感染后0,3,6,12,24和48 h時(shí)收集細(xì)胞和培養(yǎng)液,提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,使用qRT-PCR檢測BVDV 5′UTR mRNA水平。結(jié)果如圖4A所示,與Scramble對照組相比,BVDV感染OCLN KO細(xì)胞0,3,6 h后 5′UTR mRNA水平顯著性降低,表明OCLN敲除在BVDV侵入宿主細(xì)胞等早期階段。如圖4B所示,與Scramble對照組相比,BVDV感染OCLN KO細(xì)胞12,24,48 h時(shí)5′UTR mRNA水平顯著性下降,表明OCLN敲除影響B(tài)VDV mRNA復(fù)制。結(jié)果表明,OCLN敲除阻礙BVDV侵入細(xì)胞,導(dǎo)致BVDV初始感染量顯著性降低,造成BVDV mRNA復(fù)制明顯下降。圖4 qRT-PCR檢測BVDV 5′UTR mRNA水平

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]牛病毒性腹瀉疫苗的研究進(jìn)展[J]. 李世芳,龔美嬌,邵軍軍,�；菔|.  中國獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2018(04)



本文編號：3533765