病毒受體是指存在于宿主細(xì)胞表面的,能夠被病毒的吸附性蛋白識(shí)別并且與之結(jié)合,進(jìn)而引起病毒感染動(dòng)物的分子復(fù)合物。氨肽酶N（APN）是位于細(xì)胞表面的一種鋅離子依賴的金屬糖蛋向,是大多數(shù)Ⅰ型和Ⅱ型冠狀病毒發(fā)生感染時(shí)的細(xì)胞受體。雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）屬于Ⅲ型冠狀病毒中的一種禽類冠狀病毒,在進(jìn)化上被認(rèn)為是處于Ⅰ型和Ⅱ刑冠狀病毒之間,目前IBV發(fā)生感染時(shí)的功能性細(xì)胞受體還沒(méi)有完全被確定,在IBV的功能性細(xì)胞受體研究中,雞氨肽酶N的研究最為廣泛,目前IBV侵染的宿主大多限于禽類,因此更詳細(xì)深入的探討禽類APN是否是IBV感染的功能性受體是非常具有研究?jī)r(jià)值的。本實(shí)驗(yàn)從18日齡雞的腎臟中提取了其總RNA,利用設(shè)計(jì)的分段引物采用RT-PCR方法對(duì)gAPN基因進(jìn)行了分段克隆,然后利用SOE-PCR將各個(gè)片段連接構(gòu)成了大小為2906bp的gAPN全長(zhǎng)基因,將全長(zhǎng)基因連接到原核表達(dá)載體pET30a （+）中構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-gAPN,將其轉(zhuǎn)化到E.Coli Rosetta中,誘導(dǎo)得到了大小為113kDa的重組蛋白,以重組蛋白pET-gAPN免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體,間接ELISA檢測(cè)多抗血清的... 

【文章來(lái)源】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黑龍江省 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：75 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
CONTENTS
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 冠狀病毒受體的研究進(jìn)展
    1.2 IBV感染細(xì)胞相關(guān)受體的研究進(jìn)展
        1.2.1 氨肽酶N(APN)
        1.2.2 硫酸乙酰肝素
        1.2.3 唾液酸
    1.3 噬菌體展示技術(shù)研究進(jìn)展
        1.3.1 噬菌體展示技術(shù)的基本原理
        1.3.2 噬菌體展示系統(tǒng)的分類
        1.3.3 噬菌體展示技術(shù)的應(yīng)用
    1.4 研究目的與意義
2 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.1.2 菌種、載體及主要相關(guān)試劑
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)常規(guī)試劑的配制
        2.1.4 儀器設(shè)備
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 雞氨肽酶N基因的克隆
        2.2.2 gAPN原核及真核表達(dá)載體的構(gòu)建及原核重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
        2.2.3 gAPN重組蛋白的純化及復(fù)性
        2.2.4 多克隆抗血清的制備
        2.2.5 多克隆抗血清的鑒定
        2.2.6 噬菌體隨機(jī)十二肽庫(kù)對(duì)gAPN蛋白親和配體的生物淘選
        2.2.7 結(jié)合克隆的特征鑒定
        2.2.8 親和噬菌體共有氨基酸序列的推導(dǎo)及合成
        2.2.9 親和肽的生物活性鑒定
        2.2.10 親和噬菌體體內(nèi)抗病毒活性
    2.3 數(shù)據(jù)處理
3 結(jié)果
    3.1 gAPN基因的克隆
    3.2 gAPN基因序列測(cè)定與分析
    3.3 雞APN基因的重組原核、真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、蛋白表達(dá)
        3.3.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.3.2 原核重組蛋白的表達(dá)
        3.3.3 原核重組蛋白的純化
    3.4 多克隆抗體的制備及鑒定
        3.4.1 gAPN多克隆抗血清的效價(jià)測(cè)定
        3.4.2 多克隆抗體的Western blot檢測(cè)
        3.4.3 多克隆抗體的IFA檢測(cè)
    3.5 噬菌體十二肽庫(kù)對(duì)gAPN重組蛋白親和配體的生物淘選
        3.5.1 噬菌體十二肽庫(kù)對(duì)gAPN重組蛋白的四輪淘洗
        3.5.2 親和多肽的生物活性檢測(cè)
        3.5.3 親和噬菌體體內(nèi)抗病毒活性
4 討論
    4.1 gAPN基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá)
    4.2 重組蛋白的純化及生物活性的恢復(fù)
    4.3 多克隆抗體的制備及其活性檢測(cè)
    4.4 雞氨肽酶N親和肽的篩選與鑒定
    4.5 親和噬菌體體內(nèi)抗病毒分析
5 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]雞氨肽酶N基因轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞后IBV感染情況的改變[J]. 明曉波,張穎,劉瀾瀾,魏萍.  中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2010(06)
[2]雞傳染性支氣管炎病毒受體研究進(jìn)展[J]. 明曉波,魏萍.  動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2008(03)
[3]鯪生長(zhǎng)激素的重組表達(dá)及其多克隆抗體的制備[J]. 姜巨峰,張殿昌,蘇天鳳,熊小飛,江世貴.  南方水產(chǎn). 2008(01)
[4]冠狀病毒概述[J]. 李金萍.  生命科學(xué)儀器. 2007(01)
[5]異種血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因重組T7噬菌體疫苗對(duì)小鼠Lewis肺癌的抑制作用[J]. 李曉慧,唐亮,劉崠,孫紅梅,周彩存,談立松,王麗萍,張培德,張尚權(quán).  癌癥. 2006(10)
[6]以金屬蛋白酶APN/CD13為靶點(diǎn)的抗癌藥物的化學(xué)生物學(xué)研究[J]. 張濤,徐文方.  中國(guó)藥物與臨床. 2004(09)
[7]丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS5抗原模擬表位的篩選和鑒定[J]. 鐘彥偉,成軍,王剛,田小軍,陳新華,劉妍,李莉,張玲霞,陳菊梅.  中華肝臟病雜志. 2002(04)
[8]新型噬菌體表面呈現(xiàn)載體的構(gòu)建[J]. 劉志剛,俞煒源,林建波.  生物技術(shù)通訊. 2002(01)
[9]工程抗體的體外成熟[J]. 劉志剛,俞煒源.  生物技術(shù)通訊. 2002(01)
[10]噬菌體展示外源多肽的免疫原性研究[J]. 王桂云,朱筱娟,王麗.  東北師大學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2001(03)

博士論文
[1]雞傳染性支氣管炎病毒感染HeLa細(xì)胞的研究及其天然受體的鑒定[D]. 陳漢陽(yáng).華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2007

碩士論文
[1]雞APN組織定量、表達(dá)及其作為IBV受體可能性評(píng)價(jià)[D]. 明曉波.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2009



本文編號(hào)：3518792