本文關(guān)鍵詞：基于甲基化與lncRNA的絨山羊毛囊發(fā)育表觀遺傳學(xué)初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：羊絨(Cashmere)是由山羊皮膚次級(jí)毛囊產(chǎn)生的無(wú)髓纖維,生長(zhǎng)在山羊外表皮層。由于其纖維具有輕、柔、暖等特點(diǎn),有“纖維寶石”和“軟黃金”之譽(yù),在畜牧業(yè)生產(chǎn)中具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。皮膚毛囊的發(fā)育直接影響山羊絨的產(chǎn)量和品質(zhì),因此研究絨山羊毛囊發(fā)育的調(diào)控機(jī)制,對(duì)于提高羊絨的產(chǎn)量和品質(zhì)(細(xì)度和長(zhǎng)度)具有重要的意義,也是當(dāng)前絨山羊育種工作中非常重要的內(nèi)容。羊絨的生長(zhǎng)具有明顯的周期性變化,多種調(diào)控因子參與了這一過(guò)程,包括編碼RNA和非編碼RNA。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long-noncoding RNAs,lncRNAs)是一類本身不編碼蛋白、轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200 nt的RNA分子,在很多生物過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。前期對(duì)羊絨生長(zhǎng)期和休止期皮膚組織的RNA-seq測(cè)序結(jié)果表明,差異表達(dá)的lnc15479與毛囊發(fā)育相關(guān)基因Hox、KAPs、Wnt2、FGF5以及BMPs等有關(guān)。因此,為了從不同的角度揭示羊絨周期性生長(zhǎng)的分子機(jī)制,本研究對(duì)陜北白絨山羊在羊絨生長(zhǎng)期和休止期皮膚組織中Hoxc13、Msx-2和FGF5的甲基化程度進(jìn)行分析,并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)測(cè)定Hoxc13基因和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因(DNMT1、DNMT3a、DNMT3b)在羊絨生長(zhǎng)期和休止期皮膚組織中的相對(duì)表達(dá)量。同時(shí)利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù),建立了lnc15479的敲除系統(tǒng),為后續(xù)研究lnc15479的功能及作用機(jī)制提供技術(shù)支持。主要獲得了如下結(jié)果:(1)DNA甲基化分析結(jié)果表明:Hoxc13基因啟動(dòng)子區(qū)的一個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化程度在羊絨休止期顯著高于生長(zhǎng)期(P0.05),而Msx-2基因啟動(dòng)子區(qū)和FGF5基因外顯子1的甲基化狀態(tài)在羊絨生長(zhǎng)期和休止期沒(méi)有顯著變化。(2)qRT-PCR結(jié)果表明:Hoxc13基因在羊絨生長(zhǎng)期的基因表達(dá)水平極顯著高于羊絨休止期(P0.01)。而DNA甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因DNMT1、DNMT3a和DNMT3b在羊絨休止期的相對(duì)表達(dá)量都極顯著高于羊絨生長(zhǎng)期的表達(dá)量(P0.01);在同一生長(zhǎng)時(shí)期,DNMTs基因間的表達(dá)量沒(méi)有顯著差異。DNMTs基因在羊絨休止期和生長(zhǎng)期的表達(dá)量的變化趨勢(shì)與Hoxc13基因在羊絨休止期和生長(zhǎng)期甲基化程度變化趨勢(shì)相似。因此推測(cè),DNMTs通過(guò)調(diào)節(jié)Hoxc13基因的甲基化水平對(duì)羊絨的周期性生長(zhǎng)具有調(diào)控作用。(3)通過(guò)在lnc15479的上、下游各設(shè)計(jì)一個(gè)sgRNA靶位點(diǎn),構(gòu)建CRISPR/Cas9表達(dá)載體,并基于SSA修復(fù)機(jī)制,分別構(gòu)建了含有紅色熒光和綠色熒光的雙熒光報(bào)告載體系統(tǒng)。通過(guò)將表達(dá)載體和報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞來(lái)檢測(cè)該CRISPR/Cas9系統(tǒng)的工作效率。結(jié)果表明,lnc15479的CRISPR/Cas9系統(tǒng)表達(dá)載體成功構(gòu)建,根據(jù)紅色熒光和綠色熒光的表達(dá)情況及細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法,該系統(tǒng)的工作效率約為20%~30%。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究lnc15479的功能及調(diào)控機(jī)制提供技術(shù)支持。
【關(guān)鍵詞】：Hoxc13 甲基化 CRISPR/Cas9 lncRNA 絨山羊
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S827
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 第一章 文獻(xiàn)綜述13-20
• 1.1 陜北白絨山羊簡(jiǎn)介13
• 1.2 毛囊發(fā)育相關(guān)基因的國(guó)內(nèi)外研究概況13-15
• 1.2.1 Hox基因13-15
• 1.2.2 Msx-2 對(duì)毛囊發(fā)育的影響15
• 1.2.3 FGF5對(duì)毛囊發(fā)育的影響15
• 1.3 甲基化概述15-17
• 1.3.1 甲基轉(zhuǎn)移酶基因簡(jiǎn)介15
• 1.3.2 DNA甲基化15-16
• 1.3.3 DNA甲基化的功能及調(diào)控機(jī)制16
• 1.3.4 Sequenom MassARRAY?甲基化檢測(cè)技術(shù)16
• 1.3.5 BSP甲基化檢測(cè)技術(shù)16-17
• 1.4 lncRNAs17-18
• 1.4.1 lncRNAs簡(jiǎn)介17
• 1.4.2 lncRNAs的研究進(jìn)展17-18
• 1.5 CRISPR/Cas9核酸酶技術(shù)18-19
• 1.5.1 CRISPR/Cas9核酸酶技術(shù)的由來(lái)18
• 1.5.2 CRISPR/Cas9核酸酶技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)18-19
• 1.5.4 CRISPR/Cas9核酸酶技術(shù)的研究進(jìn)展19
• 1.6 研究的目的與意義19-20
• 第二章 毛囊發(fā)育相關(guān)基因的甲基化研究20-29
• 2.1 材料與方法20-24
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇與組織樣采集20
• 2.1.2 主要試劑及儀器20
• 2.1.3 DNA提取及質(zhì)量檢測(cè)20
• 2.1.4 Hoxc13基因甲基化檢測(cè)試驗(yàn)過(guò)程20-23
• 2.1.5 Msx-2、FGF5基因甲基化檢測(cè)試驗(yàn)過(guò)程23
• 2.1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析23-24
• 2.2 結(jié)果與分析24-27
• 2.2.1 DNA質(zhì)量檢測(cè)分析24
• 2.2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果24-25
• 2.2.3 Hoxc13基因甲基化差異的關(guān)聯(lián)分析25-26
• 2.2.4 Msx-2 基因甲基化差異的關(guān)聯(lián)分析26-27
• 2.2.5 FGF5基因甲基化差異的關(guān)聯(lián)分析27
• 2.3 討論27-28
• 2.4 小結(jié)28-29
• 第三章 DNMTs、Hoxc13基因在羊絨生長(zhǎng)期和休止期的表達(dá)分析29-38
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法29-32
• 3.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與皮膚樣品采集29
• 3.1.2 主要試劑及儀器（見(jiàn)附錄）29
• 3.1.3 RNA提取的準(zhǔn)備（見(jiàn)附錄）29
• 3.1.4 引物的設(shè)計(jì)29-30
• 3.1.5 總RNA的提取30
• 3.1.6 RNA質(zhì)量與濃度檢測(cè)30
• 3.1.7 反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR30-31
• 3.1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析31-32
• 3.2 結(jié)果與分析32-36
• 3.2.1 RNA質(zhì)量檢測(cè)分析32
• 3.2.2 qRT-PCR擴(kuò)增體系檢測(cè)結(jié)果32-33
• 3.2.3 羊絨生長(zhǎng)期與休止期DNMTs基因平均相對(duì)表達(dá)量33-34
• 3.2.4 羊絨生長(zhǎng)期和休止期Hoxc13基因平均相對(duì)表達(dá)量34-35
• 3.2.5 羊絨生長(zhǎng)期DNMT1、DNMT3a、DNMT3b基因的表達(dá)量35
• 3.2.6 羊絨休止期DNMT1、DNMT3a、DNMT3b基因的表達(dá)量35-36
• 3.3 討論36-37
• 3.4 小結(jié)37-38
• 第四章 靶向敲除絨山羊lnc15479的CRISPR/Cas9構(gòu)建及活性驗(yàn)證38-47
• 4.1 材料38-39
• 4.1.1 細(xì)胞株和質(zhì)粒38-39
• 4.1.2 實(shí)驗(yàn)材料和試劑39
• 4.1.3 主要儀器39
• 4.1.4 引物合成和測(cè)序39
• 4.2 方法39-43
• 4.2.1 構(gòu)建表達(dá)載體msgRNA-239-41
• 4.2.2 構(gòu)建雙熒光報(bào)告載體41-43
• 4.2.3 在HEK293T細(xì)胞中檢測(cè)CRISPR/Cas9活性43
• 4.3 結(jié)果43-45
• 4.3.1 CRISPR/Cas9真核表達(dá)載體及報(bào)告載體構(gòu)建結(jié)果43-44
• 4.3.2 CRISPR/Cas9在哺乳細(xì)胞中的活性檢測(cè)44-45
• 4.4 討論45-46
• 4.5 小結(jié)46-47
• 第五章 結(jié)論與展望47-48
• 5.1 主要結(jié)論47
• 5.2 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)47
• 5.3 需要進(jìn)一步研究的問(wèn)題47-48
• 參考文獻(xiàn)48-57
• 附錄57-73
• 致謝73-74
• 作者簡(jiǎn)介74

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 賈志海,富俊才;如何協(xié)調(diào)絨山羊發(fā)展與生態(tài)環(huán)境矛盾[J];中國(guó)畜牧雜志;2001年04期

2 張瑛;絨山羊前景及抓絨技術(shù)[J];北京農(nóng)業(yè);2001年05期

3 李金泉,尹俊;絨山羊育種研究現(xiàn)狀及展望[J];草食家畜;2001年01期

4 趙臣,葛信江,蔣俊東;怎樣給絨山羊梳絨[J];養(yǎng)殖技術(shù)顧問(wèn);2001年04期

5 ;養(yǎng)殖絨山羊與保護(hù)生態(tài)可以兼顧[J];內(nèi)蒙古畜牧科學(xué);2001年04期

6 吳志瑞;絨山羊舍飼初見(jiàn)成效 自治區(qū)領(lǐng)導(dǎo)批示鼓勵(lì)[J];內(nèi)蒙古畜牧科學(xué);2001年06期

7 徐曉峰;絨山羊圈養(yǎng)收入高[J];新農(nóng)業(yè);2001年06期

8 張玲勤;青海海西地區(qū)柴達(dá)木絨山羊持續(xù)發(fā)展的對(duì)策[J];畜牧與獸醫(yī);2002年09期

9 張會(huì)軍,李勇剛;絨山羊圈養(yǎng)技術(shù)的調(diào)查[J];吉林畜牧獸醫(yī);2002年06期

10 龔恩學(xué);提高絨山羊冬春季節(jié)舍飼效果的技術(shù)要點(diǎn)[J];遼寧畜牧獸醫(yī);2002年06期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 陳寧;;絨山羊養(yǎng)殖戶如何應(yīng)對(duì)金融危機(jī)[A];《2009中國(guó)羊業(yè)進(jìn)展》論文集[C];2009年

2 白文林;羅光彬;尹榮煥;姜午旗;張寶路;張守純;趙志輝;;中國(guó)絨山羊品種的起源及遺傳分化研究[A];第十二次全國(guó)畜禽遺傳標(biāo)記研討會(huì)論文集[C];2010年

3 姜向宏;丁慶慶;;鄂托克旗絨山羊良種繁育體系建設(shè)與思考[A];《2011中國(guó)羊業(yè)進(jìn)展》論文集[C];2011年

4 馬寧;;中國(guó)絨山羊發(fā)展的階段性特征、現(xiàn)狀及對(duì)今后發(fā)展的思考[A];《2008中國(guó)羊業(yè)進(jìn)展》論文集[C];2008年

5 孟瑞強(qiáng);張燕軍;王瑞軍;王志新;張文廣;王鵬宇;劉慧;王志英;白X;周娟娟;李金泉;;絨山羊育種信息管理系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)養(yǎng)羊?qū)W分會(huì)2012年全國(guó)養(yǎng)羊生產(chǎn)與學(xué)術(shù)研討會(huì)議論文集[C];2012年

6 丁家剛;丁巍;;構(gòu)建生態(tài)型絨山羊生產(chǎn)模式的思考與實(shí)踐[A];《2009中國(guó)羊業(yè)進(jìn)展》論文集[C];2009年

7 韓敏;張金合;馬茂榮;蘇秀玲;何俊琴;王宇;;放牧與圈養(yǎng)絨山羊血液生理生化指標(biāo)比較分析[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜內(nèi)科學(xué)分會(huì)2009年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2009年

8 劉斌;李玉榮;王峰;;中國(guó)主要絨山羊品種資源及其研究與利用現(xiàn)狀[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)養(yǎng)羊?qū)W分會(huì)全國(guó)養(yǎng)羊生產(chǎn)與學(xué)術(shù)研討會(huì)議論文集[C];2010年

9 劉興亮;高愛(ài)琴;張文廣;李金泉;王志新;張永斌;;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體Ⅱ在絨山羊皮膚中的表達(dá)[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)養(yǎng)羊?qū)W分會(huì)全國(guó)養(yǎng)羊生產(chǎn)與學(xué)術(shù)研討會(huì)議論文集[C];2010年

10 薛樹(shù)媛;金海;李華偉;李長(zhǎng)青;;不同物候期對(duì)放牧絨山羊食性與采食量的影響[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)養(yǎng)羊?qū)W分會(huì)全國(guó)養(yǎng)羊生產(chǎn)與學(xué)術(shù)研討會(huì)議論文集[C];2010年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 駐站記者 閆洪君 通訊員 石景君;阿旗絨山羊產(chǎn)業(yè)成為農(nóng)牧民增收的重要來(lái)源[N];赤峰日?qǐng)?bào);2006年

2 駐站記者 玉榮 通訊員 石景君;阿魯科爾沁旗農(nóng)牧民養(yǎng)殖絨山羊積極性高漲[N];赤峰日?qǐng)?bào);2007年

3 藏新;西藏打造絨山羊產(chǎn)業(yè)帶[N];中國(guó)民族報(bào);2007年

4 遼寧省遼寧絨山羊育種中心 王世權(quán);絨山羊產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及前景[N];河北科技報(bào);2007年

5 本報(bào)通訊員 田力;絨山羊養(yǎng)殖大有可為[N];隴東報(bào);2007年

6 高學(xué)海;扎旗推廣絨山羊改良提質(zhì)項(xiàng)目人均增收880元[N];通遼日?qǐng)?bào);2007年

7 本報(bào)記者 董亮;上肥地鄉(xiāng)：絨山羊身上梳下“軟黃金”[N];鐵嶺日?qǐng)?bào);2006年

8 黨耀翔;岢嵐傾力打造“中國(guó)絨山羊之鄉(xiāng)”[N];忻州日?qǐng)?bào);2007年

9 鐘改清;養(yǎng)絨山羊帶富山區(qū)牧民[N];伊犁日?qǐng)?bào)(漢);2007年

10 許金亭邋李占崇;推廣普及絨山羊飼養(yǎng) 清河力保羊絨霸主地位[N];中國(guó)畜牧獸醫(yī)報(bào);2008年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 段春輝;褪黑激素調(diào)控山羊絨生長(zhǎng)的模式及機(jī)理初探[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

2 張微;絨山羊微量元素銅需要量的研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

3 劉斌;絨山羊絨毛生長(zhǎng)相關(guān)基因的篩選、鑒定和多態(tài)性分析[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

4 狄冉;中國(guó)產(chǎn)絨山羊微衛(wèi)星和單核苷酸多態(tài)性研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2008年

5 白文林;中國(guó)產(chǎn)絨山羊品種父系與母系起源的分子特征及遺傳分化[D];吉林大學(xué);2009年

6 孫澤威;松嫩羊草草地放牧絨山羊營(yíng)養(yǎng)限制因素的研究[D];東北師范大學(xué);2008年

7 郭旭東;絨山羊轉(zhuǎn)胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ基因體細(xì)胞核移植胚胎的制備[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2008年

8 袁建龍;利用體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因絨山羊的研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2013年

9 許騰;絨山羊皮膚絨毛生長(zhǎng)期與靜息期基因差異表達(dá)的研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2013年

10 趙勝軍;不同氨基酸模式對(duì)絨山羊皮膚氨基酸利用的影響及機(jī)理[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 張?chǎng)?雷帕霉素對(duì)轉(zhuǎn)基因絨山羊細(xì)胞中外源基因表達(dá)的影響[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2015年

2 劉樹(shù)青;T細(xì)胞因子4(TCF-4)基因表達(dá)水平對(duì)絨山羊毛囊生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2015年

3 郭楊;羊絨周期性生長(zhǎng)特異性IncRNAs的篩選[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

4 李彥飛;用不同動(dòng)物模型對(duì)新疆南疆絨山羊主要性狀進(jìn)行遺傳分析[D];新疆農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

5 吳鐵成;基于絨山羊育種生產(chǎn)管理系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)超細(xì)超長(zhǎng)育種目標(biāo)的研究[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

6 馮帥帥;基于甲基化與lncRNA的絨山羊毛囊發(fā)育表觀遺傳學(xué)初步研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2016年

7 郭俊清;亮氨酸及β-羥基-β-甲基丁酸鈣對(duì)絨山羊免疫機(jī)能和生產(chǎn)性能影響的研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

8 蒙成志;舍飼與放牧條件對(duì)絨山羊免疫功能和抗氧化功能的影響[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

9 趙苗;絨山羊6個(gè)候選基因遺傳變異及其與經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)系研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2008年

10 宋潔;遼寧新品系絨山羊毛囊生長(zhǎng)、發(fā)育相關(guān)基因的研究[D];遼寧師范大學(xué);2008年

  本文關(guān)鍵詞：基于甲基化與lncRNA的絨山羊毛囊發(fā)育表觀遺傳學(xué)初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：351075