本文關(guān)鍵詞：基于甲基化與lncRNA的絨山羊毛囊發(fā)育表觀遺傳學(xué)初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：羊絨(Cashmere)是由山羊皮膚次級毛囊產(chǎn)生的無髓纖維,生長在山羊外表皮層。由于其纖維具有輕、柔、暖等特點(diǎn),有“纖維寶石”和“軟黃金”之譽(yù),在畜牧業(yè)生產(chǎn)中具有重要的經(jīng)濟(jì)價值。皮膚毛囊的發(fā)育直接影響山羊絨的產(chǎn)量和品質(zhì),因此研究絨山羊毛囊發(fā)育的調(diào)控機(jī)制,對于提高羊絨的產(chǎn)量和品質(zhì)(細(xì)度和長度)具有重要的意義,也是當(dāng)前絨山羊育種工作中非常重要的內(nèi)容。羊絨的生長具有明顯的周期性變化,多種調(diào)控因子參與了這一過程,包括編碼RNA和非編碼RNA。長鏈非編碼RNA(long-noncoding RNAs,lncRNAs)是一類本身不編碼蛋白、轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt的RNA分子,在很多生物過程中發(fā)揮重要的作用。前期對羊絨生長期和休止期皮膚組織的RNA-seq測序結(jié)果表明,差異表達(dá)的lnc15479與毛囊發(fā)育相關(guān)基因Hox、KAPs、Wnt2、FGF5以及BMPs等有關(guān)。因此,為了從不同的角度揭示羊絨周期性生長的分子機(jī)制,本研究對陜北白絨山羊在羊絨生長期和休止期皮膚組織中Hoxc13、Msx-2和FGF5的甲基化程度進(jìn)行分析,并利用實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)測定Hoxc13基因和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因(DNMT1、DNMT3a、DNMT3b)在羊絨生長期和休止期皮膚組織中的相對表達(dá)量。同時利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù),建立了lnc15479的敲除系統(tǒng),為后續(xù)研究lnc15479的功能及作用機(jī)制提供技術(shù)支持。主要獲得了如下結(jié)果:(1)DNA甲基化分析結(jié)果表明:Hoxc13基因啟動子區(qū)的一個CpG位點(diǎn)的甲基化程度在羊絨休止期顯著高于生長期(P0.05),而Msx-2基因啟動子區(qū)和FGF5基因外顯子1的甲基化狀態(tài)在羊絨生長期和休止期沒有顯著變化。(2)qRT-PCR結(jié)果表明:Hoxc13基因在羊絨生長期的基因表達(dá)水平極顯著高于羊絨休止期(P0.01)。而DNA甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因DNMT1、DNMT3a和DNMT3b在羊絨休止期的相對表達(dá)量都極顯著高于羊絨生長期的表達(dá)量(P0.01);在同一生長時期,DNMTs基因間的表達(dá)量沒有顯著差異。DNMTs基因在羊絨休止期和生長期的表達(dá)量的變化趨勢與Hoxc13基因在羊絨休止期和生長期甲基化程度變化趨勢相似。因此推測,DNMTs通過調(diào)節(jié)Hoxc13基因的甲基化水平對羊絨的周期性生長具有調(diào)控作用。(3)通過在lnc15479的上、下游各設(shè)計一個sgRNA靶位點(diǎn),構(gòu)建CRISPR/Cas9表達(dá)載體,并基于SSA修復(fù)機(jī)制,分別構(gòu)建了含有紅色熒光和綠色熒光的雙熒光報告載體系統(tǒng)。通過將表達(dá)載體和報告載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞來檢測該CRISPR/Cas9系統(tǒng)的工作效率。結(jié)果表明,lnc15479的CRISPR/Cas9系統(tǒng)表達(dá)載體成功構(gòu)建,根據(jù)紅色熒光和綠色熒光的表達(dá)情況及細(xì)胞計數(shù)的方法,該系統(tǒng)的工作效率約為20%~30%。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究lnc15479的功能及調(diào)控機(jī)制提供技術(shù)支持。
【關(guān)鍵詞】：Hoxc13 甲基化 CRISPR/Cas9 lncRNA 絨山羊
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S827
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 第一章 文獻(xiàn)綜述13-20
• 1.1 陜北白絨山羊簡介13
• 1.2 毛囊發(fā)育相關(guān)基因的國內(nèi)外研究概況13-15
• 1.2.1 Hox基因13-15
• 1.2.2 Msx-2 對毛囊發(fā)育的影響15
• 1.2.3 FGF5對毛囊發(fā)育的影響15
• 1.3 甲基化概述15-17
• 1.3.1 甲基轉(zhuǎn)移酶基因簡介15
• 1.3.2 DNA甲基化15-16
• 1.3.3 DNA甲基化的功能及調(diào)控機(jī)制16
• 1.3.4 Sequenom MassARRAY?甲基化檢測技術(shù)16
• 1.3.5 BSP甲基化檢測技術(shù)16-17
• 1.4 lncRNAs17-18
• 1.4.1 lncRNAs簡介17
• 1.4.2 lncRNAs的研究進(jìn)展17-18
• 1.5 CRISPR/Cas9核酸酶技術(shù)18-19
• 1.5.1 CRISPR/Cas9核酸酶技術(shù)的由來18
• 1.5.2 CRISPR/Cas9核酸酶技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)18-19
• 1.5.4 CRISPR/Cas9核酸酶技術(shù)的研究進(jìn)展19
• 1.6 研究的目的與意義19-20
• 第二章 毛囊發(fā)育相關(guān)基因的甲基化研究20-29
• 2.1 材料與方法20-24
• 2.1.1 實(shí)驗動物選擇與組織樣采集20
• 2.1.2 主要試劑及儀器20
• 2.1.3 DNA提取及質(zhì)量檢測20
• 2.1.4 Hoxc13基因甲基化檢測試驗過程20-23
• 2.1.5 Msx-2、FGF5基因甲基化檢測試驗過程23
• 2.1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析23-24
• 2.2 結(jié)果與分析24-27
• 2.2.1 DNA質(zhì)量檢測分析24
• 2.2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果24-25
• 2.2.3 Hoxc13基因甲基化差異的關(guān)聯(lián)分析25-26
• 2.2.4 Msx-2 基因甲基化差異的關(guān)聯(lián)分析26-27
• 2.2.5 FGF5基因甲基化差異的關(guān)聯(lián)分析27
• 2.3 討論27-28
• 2.4 小結(jié)28-29
• 第三章 DNMTs、Hoxc13基因在羊絨生長期和休止期的表達(dá)分析29-38
• 3.1 實(shí)驗材料與方法29-32
• 3.1.1 試驗動物與皮膚樣品采集29
• 3.1.2 主要試劑及儀器（見附錄）29
• 3.1.3 RNA提取的準(zhǔn)備（見附錄）29
• 3.1.4 引物的設(shè)計29-30
• 3.1.5 總RNA的提取30
• 3.1.6 RNA質(zhì)量與濃度檢測30
• 3.1.7 反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR30-31
• 3.1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析31-32
• 3.2 結(jié)果與分析32-36
• 3.2.1 RNA質(zhì)量檢測分析32
• 3.2.2 qRT-PCR擴(kuò)增體系檢測結(jié)果32-33
• 3.2.3 羊絨生長期與休止期DNMTs基因平均相對表達(dá)量33-34
• 3.2.4 羊絨生長期和休止期Hoxc13基因平均相對表達(dá)量34-35
• 3.2.5 羊絨生長期DNMT1、DNMT3a、DNMT3b基因的表達(dá)量35
• 3.2.6 羊絨休止期DNMT1、DNMT3a、DNMT3b基因的表達(dá)量35-36
• 3.3 討論36-37
• 3.4 小結(jié)37-38
• 第四章 靶向敲除絨山羊lnc15479的CRISPR/Cas9構(gòu)建及活性驗證38-47
• 4.1 材料38-39
• 4.1.1 細(xì)胞株和質(zhì)粒38-39
• 4.1.2 實(shí)驗材料和試劑39
• 4.1.3 主要儀器39
• 4.1.4 引物合成和測序39
• 4.2 方法39-43
• 4.2.1 構(gòu)建表達(dá)載體msgRNA-239-41
• 4.2.2 構(gòu)建雙熒光報告載體41-43
• 4.2.3 在HEK293T細(xì)胞中檢測CRISPR/Cas9活性43
• 4.3 結(jié)果43-45
• 4.3.1 CRISPR/Cas9真核表達(dá)載體及報告載體構(gòu)建結(jié)果43-44
• 4.3.2 CRISPR/Cas9在哺乳細(xì)胞中的活性檢測44-45
• 4.4 討論45-46
• 4.5 小結(jié)46-47
• 第五章 結(jié)論與展望47-48
• 5.1 主要結(jié)論47
• 5.2 主要創(chuàng)新點(diǎn)47
• 5.3 需要進(jìn)一步研究的問題47-48
• 參考文獻(xiàn)48-57
• 附錄57-73
• 致謝73-74
• 作者簡介74

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本文編號：351075