豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的豬的一種急性、高度傳染性腸道疾病，以哺乳仔豬嘔吐、嚴重腹瀉和脫水死亡為主要特征。不同品種和不同年齡的豬對本病均易感，對哺乳仔豬的危害最為嚴重。1周齡以內(nèi)的哺乳仔豬于開始腹瀉后2–4d死亡，致死率高達90%以上，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。研究表明，S基因編碼的S蛋白是PEDV的主要的結(jié)構(gòu)蛋白之一，S蛋白可以誘導機體產(chǎn)生中和抗體。本試驗根據(jù)GenBank公布的CV777S基因序列設計一對特異性引物，通過RT-PCR擴增出截短S1基因。將擴增出的片段克隆到PMD-18-T載體上，通過測序分析證實該片段與PEDV的S基因序列一致，然后將克隆化截短S1基因亞克隆到表達載體pET-32a（+），獲得了重組表達質(zhì)粒pET-S1。將重組表達質(zhì)粒pET-S1轉(zhuǎn)化宿主菌BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導，表達了截短S1蛋白。通過優(yōu)化誘導時間和IPTG的濃度，確定了誘導表達的最佳條件：誘導時間為4h，IPTG濃度為0.6mmo1/... 

【文章來源】：江西農(nóng)業(yè)大學江西省

【文章頁數(shù)】：59 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻綜述
    1 豬流行性腹瀉病毒（PEDV）研究進展
        1.1 PEDV 的分類地位及形態(tài)特征
            1.1.1 PEDV 的分類地位
            1.1.2 PEDV 的形態(tài)特征
        1.2 PEDV 的理化特征
        1.3 PEDV 的培養(yǎng)特性
        1.4 PEDV 的病原性
        1.5 PEDV 遺傳分子生物學特性
            1.5.1 基因組結(jié)構(gòu)
            1.5.2 非結(jié)構(gòu)基因
            1.5.3 結(jié)構(gòu)基因及其產(chǎn)物
    2 PEDV 診斷方法
        2.1 免疫電鏡法
        2.2 免疫熒光法
        2.3 病毒中和法
        2.4 RT–PCR 法
        2.5 ELISA 法
    3 PEDV S 蛋白研究進展
    4 本試驗的目的和意義
    5 研究內(nèi)容與試驗流程
        5.1 研究內(nèi)容
        5.2 試驗流程
第二章 豬流行性腹瀉病毒截短 S1 基因的原核表達
    1 材料
        1.1 試驗材料
        1.2 主要儀器設備
        1.3 試劑、培養(yǎng)基的配制
        1.4 瓊脂糖凝膠電泳所用試劑的配制
        1.5 SDS-PAGE 試劑配制
        1.6 蛋白純化試劑的配制
        1.7 蛋白透析復性液的配制
            1.7.1 透析袋處理液
            1.7.2 透析復性液
        1.8 Western Blot 試劑配制
    2 試驗方法
        2.1 重組質(zhì)粒 PMD-S1 的構(gòu)建
            2.1.1 引物的設計
            2.1.2 病毒 RNA 的提取
            2.1.3 cDNA 的合成
            2.1.4 目的基因的 PCR 擴增
            2.1.5 目的基因的回收純化
            2.1.6 目的基因的 T-A 克隆
            2.1.7 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
            2.1.8 重組菌的篩選和鑒定
        2.2 重組表達質(zhì)粒 pET-S1 的構(gòu)建
            2.2.1 帶有粘性末端的目的基因及原核表達載體的制備
            2.2.2 表達載體與目的基因的連接
            2.2.3 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
            2.2.4 重組表達菌的篩選和鑒定
        2.3 目的基因的誘導表達
            2.3.1 表達條件的優(yōu)化
            2.3.2 重組蛋白的大量表達
            2.3.3 重組蛋白表達形式的鑒定
        2.4 重組蛋白純化、復性
            2.4.1 咪唑濃度優(yōu)化及重組蛋白純化
            2.4.2 重組蛋白透析復性
        2.5 SDS－PAGE 分析
        2.6 Western Blot 分析
    3 試驗結(jié)果
        3.1 重組質(zhì)粒 PMD-S1 的構(gòu)建
            3.1.1 目的基因的 RT-PCR 擴增
            3.1.2 重組質(zhì)粒 PMD-S1 的篩選和鑒定
        3.2 重組表達質(zhì)粒 pET-S1 的構(gòu)建
            3.2.1 帶有粘性末端的表達載體 pET-32a(+)及目的基因的制備
            3.2.2 pET-S1 重組質(zhì)粒的篩選和鑒定
        3.3 重組蛋白的表達
            3.3.1 誘導時間的優(yōu)化
            3.3.2 IPTG 誘導濃度的優(yōu)化
            3.3.3 重組蛋白表達形式的鑒定
            3.3.4 咪唑濃度優(yōu)化
            3.3.5 重組蛋白的純化
            3.3.6 復性重組蛋白的 SDS-PAGE 分析
            3.3.7 重組蛋白的 Western Blot 分析
    4 討論
        4.1 S 蛋白的基因表達區(qū)域的選擇
        4.2 表達系統(tǒng)的選擇
        4.3 重組 S 蛋白的純化與復性
第三章 重組蛋白間接 ELISA 方法的建立
    1 材料
        1.1 試驗材料
        1.2 溶液及試劑的配制
    2 試驗方法
        2.1 間接 ELISA 方法的操作步驟
        2.2 抗原包被濃度及血清稀釋倍數(shù)的確定
        2.3 酶標二抗稀釋度的確定
        2.4 封閉液的確定
        2.5 封閉時間的確定
        2.6 血清作用時間的確定
        2.7 酶標二抗作用時間的確定
        2.8 顯色時間的確定
        2.9 間接 ELISA 陰、陽性血清臨界值的確定
        2.10 特異性試驗
        2.11 重復性試驗
        2.12 臨床樣品的檢測
    3 結(jié)果與分析
        3.1 抗原包被濃度及血清稀釋倍數(shù)的確定
        3.2 酶標二抗稀釋度的確定
        3.3 封閉液的確定
        3.4 封閉時間的確定
        3.5 血清作用時間的確定
        3.6 酶標二抗作用時間的確定
        3.7 顯色時間的確定
        3.8 間接 ELISA 陰、陽性血清臨界值的確定
        3.9 特異性試驗
        3.10 重復性試驗
        3.11 臨床樣品的檢測
    4 討論
        4.1 抗原的純度對 ELISA 的影響
        4.2 抗原包被濃度的影響
        4.3 血清稀釋倍數(shù)的影響
        4.4 封閉液對 ELISA 的影響
全文總結(jié)
參考文獻
致謝



本文編號：3497739