豬瘟是由豬瘟病毒（Classical Swine Fever Virus,CSFV）引起的一種急性、烈性、高度接觸性傳染病,在我國仍時有發(fā)生,給養(yǎng)豬業(yè)造成重大損失。C株是世界上應用最為廣泛的減毒疫苗株。大量數(shù)據(jù)表明,C株疫苗免疫效力好、安全性高,對小豬、懷孕母豬甚至是處于免疫抑制的豬群均不造成病理損傷,但是這種類型的減毒活疫苗刺激機體產(chǎn)生的抗體,很難和野毒感染豬產(chǎn)生的抗體區(qū)分開,這不利于控制豬瘟的流行與凈化。為了能區(qū)分疫苗免疫動物和感染動物,DIVA疫苗是目前的研究熱點。E2囊膜糖蛋白是豬瘟病毒的主要結構蛋白,是豬瘟病毒毒力及宿主范圍的主要決定性因素,位于病毒粒子外表面,有跨膜區(qū),是建立豬瘟病毒血清學檢測方法的主要抗原。因此,豬瘟病毒E2蛋白是開發(fā)豬瘟病毒新型疫苗及診斷試劑的重要蛋白分子。本研究利用原核表達系統(tǒng)表達了豬瘟病毒的E2蛋白,利用純化的E2蛋白制備了豬瘟病毒E2蛋白單克隆抗體,進一步利用制備的單克隆抗體建立了豬瘟病毒的間接免疫熒光檢測方法;另外,利用純化的E2蛋白初步研制了豬瘟E2蛋白亞單位疫苗,免疫攻毒試驗結果表明,研制的亞單位疫苗免疫效果良好,為豬瘟標記亞單位疫苗的開發(fā)奠... 

【文章來源】：揚州大學江蘇省

【文章頁數(shù)】：93 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

圖１．４．ｐＭＤ１８Ｔ－ＥＴ質粒雙酶切（１？４：?ｐＭＤ１８Ｔ－Ｅ：２質粒；５？６：?ｐＭＤ１８Ｔ－Ｅ２質粒雙酶切）??

?＾??在３８?ｋＤ處（包括標簽蛋白），出現(xiàn)預期大小的目的蛋白，而且當ＩＰＴＧ誘導表達４?ｈ時，??目的蛋白表達量最多（圖１．９）。??Ｍ?１?２?３?４??，５０ｋＤ??麵．禱?．??７０ｋＤ??２０Ｈ）?－?％ｈ＇?＾?ｉ??—■ｍｕ??圖１．９．ＩＰＴＧ誘導表達時間的確定（１？４：０ｈ，?２ｈ，４ｈ，?５ｈ）??Ｆｉｇ?１．９．?Ｔｈｅ?ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｉｎｄｕｃｉｎｇ?ｔｉｍｅ?ｏｆ?ＩＰＴＧ?ｆｏｒ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?（１－４：?Ｏｈ，?２ｈ，?４ｈ，?５ｈ）??因此，最終確定重組表達菌ｐＥＴ２８ａ－ＣＳＦＶ－Ｅ２的最佳誘導表達條件為：ＩＰＴＧ濃度為??０．２ｍｍｏｌ／Ｌ，誘導時間為４ｈ。??３．７純化Ｅ２蛋白的ＳＤＳ＿ＰＡＧＥ檢測??以０．２?ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ，對４００?ｍｌ重組菌ｐＥＴ２８ａ－ＣＳＦＶ－Ｅ２進行大量誘導表達，加入??ＩＰＴＧ?４?ｈ后停止誘導，將誘導菌液１２０００?ｒｐｍ離心３０?ｍｉｎ收集菌體沉淀，著體超聲波處理??后

Ｗ轉??Ｉ：??圖１．１０．Ｅ２蛋白純化后的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ?（１？８：洗脫液ＢｕｆｆｅｒＤ中的蛋白）??Ｆｉｇ?１．１０．?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?Ｅ２?ｐｕｒｉｆｉｅｄ?ｐｒｏｔｅｉｎ?（１￣８：?Ｐｒｏｔｅｉｎｓ?ｉｎ?Ｂｕｆｆｅｒ?Ｄ?）??３．８?Ｅ２?蛋白的?Ｗｅｓｔｅｍ－ｂｌｏｔ?檢測??Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ檢測結果顯示，表達的Ｅ２蛋白可與商品化ＣＳＦＶ?Ｅ２單抗發(fā)生了特異性反??應，在預期３８ｋＤ位置出現(xiàn)目的蛋白條帶，表明表達的Ｅ２蛋白具有良好的抗原性（圖】．１１?）。??１５０ｋＤ??畫??１ｂ?＿??■細??圖１．１１?Ｅ２蛋白的ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ檢測??Ｆｉｇｌ．ｌ?１?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ?ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ?ｏｆ?Ｅ２?ｐｒｏｔｅｉｎ??

【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：3497683