簇狀規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列（CRISPR）/CRISPR相關(guān)蛋白（Cas）系統(tǒng)是一種針對入侵核酸的可遺傳性原核適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。CRISPR/Cas系統(tǒng)可以產(chǎn)生高度特異性的基因雙鏈斷裂,并通過非同源末端連接（NHEJ）或者同源重組（HR）進(jìn)行修復(fù),如今已經(jīng)成為許多生物方便有效的基因組編輯工具。結(jié)核分枝桿菌因其基因操作的復(fù)雜性,其基因組研究存在諸多困難,因此,CRISPR/Cas系統(tǒng)的出現(xiàn)對結(jié)核分枝桿菌的研究具有里程碑式意義。本文圍繞CRISPR/Cas系統(tǒng)在結(jié)核分枝桿菌中的應(yīng)用,綜述了國內(nèi)外最新的研究進(jìn)展,為結(jié)核分枝桿菌研究方法的選擇提供參考。 

【文章來源】：畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2020,51(11)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：9 頁

【部分圖文】：

CRISPR 免疫的3個階段[16]

Ⅱ型CRISPR-Cas系統(tǒng)是最常用的基因組編輯工具,Ⅱ型CRISPR-Cas系統(tǒng)的Cas9蛋白可以通過兩個核酸裂解域(RuvC和HNH),裂解靶DNA鏈并產(chǎn)生雙鏈斷裂(DSB)[9],從而進(jìn)行基因編輯。CRISPR干擾(CRISPRi)系統(tǒng)是通過使用核酸內(nèi)切酶缺陷型Cas9(又稱dCas9)開發(fā)的一種改良的CRISPR系統(tǒng),其通過人為在Cas9每個結(jié)構(gòu)域(分別是D10A和H840A)中引入點(diǎn)突變,突變后的Cas9蛋白不具備裂解活性,但不影響其與靶基因的結(jié)合,可以通過sgRNA引導(dǎo)至靶基因,達(dá)到靶向基因調(diào)控的作用,該系統(tǒng)可以將基因表達(dá)抑制數(shù)千倍以上[42]。該系統(tǒng)與RNAi有顯著的不同,RNAi的基因調(diào)控需要在翻譯之前破壞已轉(zhuǎn)錄的信使RNA,而CRISPRi可以利用RNA直接阻斷轉(zhuǎn)錄。2015年,由Choudhary等[43]首次將CRISPRi應(yīng)用在結(jié)核分枝桿菌中,通過引入化膿性鏈球菌(革蘭陽性菌)的dCas9,并使用ATc誘導(dǎo)型啟動子來實(shí)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌靶基因的受控表達(dá)。2016年,Singh等[5]在Choudhary等的研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步驗(yàn)證了該系統(tǒng)對結(jié)核分枝桿菌必需基因的抑制作用,并證明了CRISPRi對結(jié)核分枝桿菌基因組的顯著抑制作用。2017年,Rock等[44]篩選了11種不同來源的Cas9蛋白,發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)的dCas9 Sth1最為有效,且蛋白毒性最小。加入小分子誘導(dǎo)劑脫水四環(huán)素或強(qiáng)力霉素可誘導(dǎo)Sth1 dCas9和sgRNA表達(dá),從而導(dǎo)致靶基因的轉(zhuǎn)錄沉默,這種CRISPRi系統(tǒng)為結(jié)核基因組(圖3)[6],尤其是針對不能被傳統(tǒng)基于重組的基因編輯工具操作的必需基因的研究提供了簡單、快速、高效的工具,這也為快速尋找結(jié)核藥物靶點(diǎn)、開發(fā)新型抗結(jié)核藥物提供了可能[6],并且該系統(tǒng)被證明可以同時抑制多個靶基因,這對于生長緩慢的結(jié)核分枝桿菌具有重要意義。目前,這種新型的CRISPRi系統(tǒng)已經(jīng)在結(jié)核分枝桿菌的基因組研究領(lǐng)域得到應(yīng)用[45-46]。2.3 結(jié)核分枝桿菌的核酸檢測

基因分型是表征結(jié)核分枝桿菌的細(xì)菌進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育的重要手段[49],可以更好地了解病原體特定的傳播和發(fā)病機(jī)制。CRISPR序列是由一段交替的同向DNA重復(fù)序列(DRs)和可變的間隔序列組成。在CRISPR序列中,同向DNA重復(fù)序列的大小和順序幾乎沒有差別,但間隔序列在不同致病菌、相同致病菌的不同血清型和不同菌株之間差異很大,所以從數(shù)量和性質(zhì)上分析 CRISPR 間隔區(qū)的結(jié)構(gòu)可以進(jìn)行有效的基因分型[50]。因?yàn)榻Y(jié)核分枝桿菌復(fù)合體(Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC)成員基因組中CRISPR結(jié)構(gòu)的存在,Kamerbeek等[51]開發(fā)了間隔區(qū)寡核苷酸分型(spacer oligonucletide typing,Spoligotyping),這種方法基于體外擴(kuò)增的DNA與多個間隔寡核苷酸的應(yīng)變依賴性雜交模式,對由保守DR隔開的43個寡核苷酸間隔子進(jìn)行分析,該方法具有高度可重復(fù)性,已發(fā)展成為大型分子流行病學(xué)項(xiàng)目的高通量檢測方法,被廣泛用于結(jié)核分枝桿菌的分型等相關(guān)研究中[52-54],同時也已經(jīng)被應(yīng)用到其他生物中[55-56]。當(dāng)前有兩種方法用于獲取spoligotype。第1種方法(原始方法)基于反向雜交,將PCR產(chǎn)物與含有合成寡核苷酸的膜上雜交,該合成寡核苷酸具有與間隔序列互補(bǔ)的序列,使其中每個間隔子的序列均附著在膜上的特定區(qū)域[57],當(dāng)PCR產(chǎn)物與特定寡核苷酸序列未產(chǎn)生標(biāo)記,則表明在所檢查的菌株中不存在相應(yīng)的間隔區(qū)序列。第2種方法基于Luminex技術(shù)(Luminex technology),其中,每個間隔寡核苷酸通過共價(jià)連接至微球,使用微球用作捕獲探針,同時每個微球上還包含兩個共價(jià)連接的熒光染料,一束激光將激發(fā)熒光染料以識別間隔子,第二激光將激發(fā)結(jié)合到含有間隔子的PCR產(chǎn)物的報(bào)道分子上[55]。圖4 CRISPR-MTB方案[48]


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