鴨病毒性肝炎（Duck Viral Hepatitis, DVH）是雛鴨的一種急性致死性疾病,以肝炎和高死亡率為主要特征,病原是鴨肝炎病毒（Duck Hepatitis Virus, DHV）。我國流行的鴨肝炎以A型鴨甲肝病毒（Duck Hepatitis A Virus, DHAV-1）為主。DHAV-1由于個體很小,純化較為困難。通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備DHAV-1類病毒顆粒（virus-like particle, VLP）,可以更方便的獲得病毒人工抗原,通過純化,可將其用于DHAV-1的檢測,以輔助該病的預(yù)防和控制工作,亦可作為潛在的候選疫苗或以此為抗原制備單克隆抗體建立免疫學(xué)診斷方法奠定基礎(chǔ)。小RNA病毒（Picornavirus）病毒衣殼具有相似的組裝模式,以3CD蛋白水解酶將P1結(jié)構(gòu)蛋白前蛋白切割成單一的結(jié)構(gòu)蛋白再組裝而成。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)DHV-1JX株基因組序列,設(shè)計(jì)含有BamH Ⅰ和Sai Ⅰ酶切位點(diǎn)的P1基因引物,含有Xho Ⅰ和Kpn Ⅰ酶切位點(diǎn)的3CD基因引物,以JX株RNA為模板,RT-PCR擴(kuò)增P1和3CD基因。隨后運(yùn)用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng),將D... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：51 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 DHAV概述
        1.1 DHAV的流行現(xiàn)狀
        1.2 DHAV-1的分類地位
        1.3 DHAV的病原學(xué)特性
        1.4 DHAV的純化
        1.5 DHAV病原檢測
    2 類病毒顆粒的研究概述
        2.1 小RNA病毒VLP組裝研究
        2.2 VLP的應(yīng)用
    3 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)
    4 本研究的目的與意義
第二章 重組桿狀病毒vBac-P1-3CD的獲得及DHAV-1病毒樣顆粒的表達(dá)
    1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 毒株、菌株、質(zhì)粒及細(xì)胞
        1.2 主要試劑
        1.3 培養(yǎng)基
    2 試驗(yàn)方法
        2.1 P1、3CD基因的引物設(shè)計(jì)與合成
        2.2 P1和3CD基因的克隆
            2.2.1 病毒RNA的提取
            2.2.2 RT-PCR擴(kuò)增及檢測
            2.2.3 RT-PCR產(chǎn)物回收與純化
            2.2.4 RT-PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體的連接
            2.2.5 E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備
            2.2.6 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
            2.2.7 質(zhì)粒DNA的提取
            2.2.8 重組質(zhì)粒的鑒定
            2.2.9 序列比對
        2.3 構(gòu)建供體質(zhì)粒pFastBac Dual-P1-3CD
            2.3.1 P1基因和pFastBac Dual質(zhì)粒雙酶切
            2.3.2 P1與pFastBac Dual質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物的連接、轉(zhuǎn)化及鑒定
            2.3.3 3CD基因和pFastBac Dual-P1質(zhì)粒雙酶切
            2.3.4 3CD基因與pFastBac Dual-P1質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物的連接、轉(zhuǎn)化及鑒定
        2.4 構(gòu)建穿梭質(zhì)粒Bacmid-P1-3CD
            2.4.1 制備DH10感受態(tài)細(xì)胞
            2.4.2 pFastBac Dual-P1-3CD質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10感受態(tài)細(xì)胞
            2.4.3 重組桿狀質(zhì)粒DNA的提取
            2.4.4 重組桿狀質(zhì)粒的鑒定
        2.5 重組桿狀病毒vBac-P1-3CD的獲得
            2.5.1 重組桿狀質(zhì)粒轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf-9
            2.5.2 感染Sf-9細(xì)胞收獲重組桿狀病毒
        2.6 DHAV-1類病毒顆粒的鑒定
            2.6.1 病毒滴度的測定
            2.6.2 病毒感染Sf-9細(xì)胞
            2.6.3 電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)類病毒顆粒
            2.6.4 Western blot檢測目的基因
            2.6.5 類病毒顆粒的初步純化
            2.6.6 類病毒顆粒負(fù)染電鏡觀察
    3 試驗(yàn)結(jié)果
        3.1 P1、3CD基因的克隆
        3.2 pFastBac Dual-P1-3CD質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.3 穿梭質(zhì)粒Bacmid-P1-3CD的構(gòu)建
        3.4 重組桿狀病毒的獲得
        3.5 感染細(xì)胞的超薄切片觀察
        3.6 重組蛋白的表達(dá)
        3.7 DHAV-1 VLP的純化及觀察
    4 討論
        4.1 重組桿狀病毒的構(gòu)建
        4.2 VLP的形成及特性分析
    5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Ⅰ型鴨肝炎病毒概述[J]. 范衛(wèi)國,杜佳慧,曹瑞兵,陳溥言.  動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2009(11)
[2]Ⅰ型鴨肝炎病毒逆轉(zhuǎn)錄套式PCR檢測方法的建立[J]. 黃顯明,張小飛,李春芬,廖俊偉,毛火云.  中國獸醫(yī)科學(xué). 2008(01)
[3]Ⅰ型鴨病毒性肝炎病毒RT-PCR檢測方法的建立[J]. 程安春,汪銘書,信洪一,陳海軍,楊苗,郭宇飛,朱德康,賈仁勇,袁桂萍,陳孝躍.  中國獸醫(yī)科學(xué). 2007(01)
[4]Ⅰ型鴨病毒性肝炎病毒RT-PCR檢測方法的建立[J]. 馬秀麗,宋敏訓(xùn),黃兵,廖明,辛朝安.  家禽科學(xué). 2006(11)
[5]Ⅱ型鴨肝炎病毒變異株的鑒定[J]. 鄭獻(xiàn)進(jìn),張大丙,曲豐發(fā),丁春宇.  中國獸醫(yī)雜志. 2006(05)
[6]鴨肝炎病毒單克隆抗體的研制[J]. 楊萍萍,宋敏訓(xùn),艾武,馬秀麗,崔言順.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2006(02)
[7]Expression,purification and characterization of enterovirus-71 virus-like particles[J]. Yao-Chi Chung Jen-Huang Huang Chia-Wei Lai Heng-Chun Sheng Yu-Chen Hu,Department of Chemical Engineering,National Tsing Hua University,Hsinchu 300,Taiwan,ChinaShin-Ru Shih,School of Medical Technology,Chang Gung University,Taoyuan 333.Taiwan,ChinaMei-Shang Ho,Institute of Biomedical Sciences,Academia Sinica.Taipei 11529.Taiwan.China.  World Journal of Gastroenterology. 2006(06)
[8]Dot-ELISA用于雛鴨病毒性肝炎的診斷[J]. 馬秀麗,宋敏訓(xùn),李峰,王春玲,劉玉山.  山東家禽. 2004(09)
[9]鴨病毒性肝炎病毒的分離鑒定[J]. 沈國順,劉麗霞.  畜牧與獸醫(yī). 2004(02)
[10]單克隆抗體PAP法對實(shí)驗(yàn)感染雛鴨體內(nèi)鴨肝炎病毒的定位檢測[J]. 程國富,周詩其,熊道煥,胡薛英.  河南畜牧獸醫(yī). 1998(01)

碩士論文
[1]鴨病毒性肝炎病毒分離與鑒定及其RT-PCR快速診斷方法的建立[D]. 蒙秋.廣西大學(xué) 2007
[2]鴨肝炎病毒（DHV-1）的純化及結(jié)構(gòu)蛋白分析[D]. 胡燕賓.西南大學(xué) 2007



本文編號：3462441