根據(jù)GenBank中編碼貓杯狀病毒（FCV）衣殼蛋白ORF2的保守序列,設(shè)計并合成了一對引物和相應(yīng)的TaqMan探針,建立了快速檢測FCV的熒光定量PCR方法.通過對該方法的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進行優(yōu)化,建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線,給出了特異性、敏感性和重復(fù)性實驗,并對臨床24份疑似樣品（其中陽性3份、陰性21份）進行檢測.結(jié)果表明:該方法檢測cDNA的線性關(guān)系為0.992,線性范圍為2.26×1011-2.26×101拷貝/μL;可檢測出樣品中的FCV,其他貓相關(guān)病毒檢測為陰性;批內(nèi)重復(fù)性實驗變異系數(shù)為2.158%,與病毒分離結(jié)果相符. 

【文章來源】：吉林大學(xué)學(xué)報(理學(xué)版). 2013,51(05)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

引物和探針濃度的優(yōu)化

雙蒸餾水進行熒光定量PCR檢測，結(jié)果如圖3所示．由圖3可見，僅FCV產(chǎn)生熒光信號，呈現(xiàn)良好的特異性．圖2實時熒光定量PCR方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig．2StandardcurveofrealtimePCR圖3特異性實驗結(jié)果Fig．3Testofspecificity2．4敏感性實驗結(jié)果將計算出拷貝數(shù)的質(zhì)粒做10倍系列稀釋，進行熒光定量PCR實驗，結(jié)果如圖4所示．由圖4可見，熒光定量PCR檢測到的最低濃度為2．26×101拷貝/μL，表明該方法具有較高的靈敏度．2．5重復(fù)性實驗結(jié)果對陽性樣品進行4次重復(fù)檢測，結(jié)果如圖5所示．通過統(tǒng)計分析可得變異系數(shù)為2．158%，表明該方法具有較好的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性．圖4敏感性實驗結(jié)果Fig．4Testofsensibility圖5重復(fù)性實驗結(jié)果Fig．5Curvesofrepeattest2．6疑似臨床樣品的檢測及病毒分離鑒定結(jié)果M:DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn);1，2，3:PCR產(chǎn)物;4:陰性對照．圖6RT-PCR結(jié)果Fig．6ResultofRT-PCR用優(yōu)化后的熒光定量PCR方法對24份疑似患FCV病貓的唾液樣品進行檢測，結(jié)果為陽性樣本3份，陰性樣本21份，F(xiàn)CV的檢出率為12．5%．采用F81細(xì)胞從熒光定量PCR陽性樣本中分離病毒，3d后，細(xì)胞均出現(xiàn)圓縮、葡萄串樣和細(xì)胞脫落等病變．采用普通RT-PCR鑒定細(xì)胞培養(yǎng)物，結(jié)果均獲得預(yù)期核苷酸片段，如圖6所示．因此，本文建立的熒光定量PCR方法可較敏感地檢測出陽性樣本．綜上可見，本文建立的FCV熒光定量PCR方法，檢測標(biāo)準(zhǔn)品的線性關(guān)系為0．992，最低檢測為2．26×101拷貝/μL，具有較高的敏感性;特異性實驗結(jié)果表明，該方法僅能檢測FCV，無法檢測其他相關(guān)病毒，呈現(xiàn)出良好的特異性;重復(fù)性實驗表明，批內(nèi)變異系數(shù)為2．158%，重復(fù)性較好;臨床疑似樣品的檢測率為12．5%，與文獻［17］結(jié)果相符．976吉林大學(xué)學(xué)報(理學(xué)版)第51卷

雙蒸餾水進行熒光定量PCR檢測，結(jié)果如圖3所示．由圖3可見，僅FCV產(chǎn)生熒光信號，呈現(xiàn)良好的特異性．圖2實時熒光定量PCR方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig．2StandardcurveofrealtimePCR圖3特異性實驗結(jié)果Fig．3Testofspecificity2．4敏感性實驗結(jié)果將計算出拷貝數(shù)的質(zhì)粒做10倍系列稀釋，進行熒光定量PCR實驗，結(jié)果如圖4所示．由圖4可見，熒光定量PCR檢測到的最低濃度為2．26×101拷貝/μL，表明該方法具有較高的靈敏度．2．5重復(fù)性實驗結(jié)果對陽性樣品進行4次重復(fù)檢測，結(jié)果如圖5所示．通過統(tǒng)計分析可得變異系數(shù)為2．158%，表明該方法具有較好的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性．圖4敏感性實驗結(jié)果Fig．4Testofsensibility圖5重復(fù)性實驗結(jié)果Fig．5Curvesofrepeattest2．6疑似臨床樣品的檢測及病毒分離鑒定結(jié)果M:DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn);1，2，3:PCR產(chǎn)物;4:陰性對照．圖6RT-PCR結(jié)果Fig．6ResultofRT-PCR用優(yōu)化后的熒光定量PCR方法對24份疑似患FCV病貓的唾液樣品進行檢測，結(jié)果為陽性樣本3份，陰性樣本21份，F(xiàn)CV的檢出率為12．5%．采用F81細(xì)胞從熒光定量PCR陽性樣本中分離病毒，3d后，細(xì)胞均出現(xiàn)圓縮、葡萄串樣和細(xì)胞脫落等病變．采用普通RT-PCR鑒定細(xì)胞培養(yǎng)物，結(jié)果均獲得預(yù)期核苷酸片段，如圖6所示．因此，本文建立的熒光定量PCR方法可較敏感地檢測出陽性樣本．綜上可見，本文建立的FCV熒光定量PCR方法，檢測標(biāo)準(zhǔn)品的線性關(guān)系為0．992，最低檢測為2．26×101拷貝/μL，具有較高的敏感性;特異性實驗結(jié)果表明，該方法僅能檢測FCV，無法檢測其他相關(guān)病毒，呈現(xiàn)出良好的特異性;重復(fù)性實驗表明，批內(nèi)變異系數(shù)為2．158%，重復(fù)性較好;臨床疑似樣品的檢測率為12．5%，與文獻［17］結(jié)果相符．976吉林大學(xué)學(xué)報(理學(xué)版)第51卷

【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3458383