本試驗(yàn)對(duì)豬腦心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus,EMCV）2A蛋白進(jìn)行原核表達(dá)和純化。采用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng),將EMCV 2A基因插入原核表達(dá)載體pET-28a-sumo中構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-EMCV-2A,經(jīng)PCR和測(cè)序鑒定無誤。將重組原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中,超聲破碎后,2A蛋白的表達(dá)主要以包涵體形式存在。通過優(yōu)化蛋白表達(dá)條件,使目的蛋白能夠?qū)崿F(xiàn)可溶性表達(dá)。利用磁珠純化方法對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化,并以SDS-PAGE和Western blotting進(jìn)行雙重鑒定。結(jié)果顯示,本試驗(yàn)成功構(gòu)建2A的重組表達(dá)質(zhì)粒;重組蛋白分子質(zhì)量約為25 ku,與預(yù)期大小一致;IPTG濃度1.0 mmol/L、16℃低溫誘導(dǎo)16 h為最佳誘導(dǎo)條件,約有50%的蛋白呈現(xiàn)可溶性表達(dá);純化后獲得2A重組蛋白。本試驗(yàn)通過對(duì)EMCV 2A蛋白的原核表達(dá)及純化,成功獲得純度較高的EMCV 2A蛋白,為進(jìn)一步闡明EMCV的分子致病機(jī)制以及研發(fā)基因疫苗和抗病毒藥物奠定基礎(chǔ)。 

【文章來源】：中國畜牧獸醫(yī). 2020,47(11)北大核心

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2A蛋白純化結(jié)果

將抗His-tag抗體作為一抗,HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG作為二抗,對(duì)純化2A蛋白進(jìn)行Western blotting分析。在檢測(cè)結(jié)果中25 ku處出現(xiàn)目的條帶,空載體對(duì)照無蛋白條帶(圖7)。3 討 論

PCR鑒定構(gòu)建的pET28a-EMCV-2A重組質(zhì)粒,經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,在471 bp處出現(xiàn)目的基因條帶(圖1),與預(yù)期基因片段大小相符。2.2 誘導(dǎo)表達(dá)與可溶性分析


本文編號(hào)：3457748