1、鴨瘟病毒UL1基因的生物信息學(xué)分析對DPV UL1基因的核酸序列及其編碼蛋白的氨基酸序列進(jìn)行生物信息、學(xué)分析。結(jié)果表明：DPV UL1基因編碼的蛋白由236aa組成,分子量約為26221.08Da,等電點(diǎn)為8.480,其中Val、Gly、Arg的含量最高,分別為9.8%、8.5%、8.1%。對其編碼蛋白的氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析,表明DPV更接近α皰疹病毒亞科的Simplexvirus屬。DPV UL1基因編碼蛋白有信號肽、無跨膜區(qū),其抗原表位主要集中在27-33、63-64、87-106、151-153、155-157、167-196、204-210、214-236aa。預(yù)測DPV UL1編碼蛋白可能含有5個(gè)O-糖基化位點(diǎn)、7個(gè)絲氨酸位點(diǎn)、2個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)、1個(gè)酪氨酸位點(diǎn)。亞細(xì)胞定位分析表明,DPV UL1基因編碼蛋白存在于細(xì)胞核、細(xì)胞漿及線粒體中的可能性分別為4.3%、17.4%和47.8%。2、鴨瘟病毒UL1基因的原核表達(dá)、蛋白純化及多抗制備由于DPV UL1的全基因在原核表達(dá)系統(tǒng)中無法表達(dá),所以根據(jù)生物信息學(xué)分析,設(shè)計(jì)了一對特異性引物,擴(kuò)增UL1基因上除去信號肽部分但包含了主... 

【文章來源】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)四川省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
第一部分 引言
    1 皰疹病毒膜融合的機(jī)理
    2 皰疹病毒的gH/gL復(fù)合物
    3 皰疹病毒gL蛋白的特點(diǎn)
    4 皰疹病毒gL蛋白的功能
    5 展望
    6 本研究目的和意義
第二部分 試驗(yàn)研究
    1 試驗(yàn)材料
        1.1 DPV UL1基因序列與偏愛性數(shù)據(jù)
        1.2 毒株、菌株、抗體、質(zhì)粒、引物、細(xì)胞
        1.3 試驗(yàn)動物
        1.4 主要儀器設(shè)備
        1.5 主要試劑及配制
            1.5.1 主要試劑
            1.5.2 試劑配制
    2 試驗(yàn)方法
        2.1 生物信息學(xué)分析
        2.2 鴨瘟病毒UL1基因克隆、原核表達(dá)、蛋白純化及多抗制備
            2.2.1 DPV基因組DNA的提取
            2.2.2 DPV UL1基因的PCR擴(kuò)增與T克隆
            2.2.3 感受態(tài)細(xì)胞制備
            2.2.4 感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化
            2.2.5 T克隆的鑒定
            2.2.6 重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)-gLt的構(gòu)建
            2.2.7 重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)-gLt的表達(dá)
            2.2.8 重組gLt蛋白的制備與純化
            2.2.9 重組gLt蛋白的透析與凍干
            2.2.10 Western Blot法檢測重組gLt蛋白的反應(yīng)原性
            2.2.11 制備兔抗重組gLt蛋白多克隆抗體
            2.2.12 瓊脂雙向擴(kuò)散法檢測抗體效價(jià)
            2.2.13 飽和硫酸銨鹽析沉淀法粗提IgG
            2.2.14 High Q陰離子交換層析法純化IgG
            2.2.15 兔抗gLt蛋白IgG的純度鑒定
        2.3 鴨瘟病毒UL1蛋白在感染DEF內(nèi)的定位分析
            2.3.1 間接免疫熒光法檢測方法的建立
            2.3.2 間接免疫熒光法檢測方法的優(yōu)化
            2.3.3 特異性檢測
            2.3.4 結(jié)果判定
            2.3.5 UL1蛋白在DEF內(nèi)定位的動態(tài)分析
        2.4 鴨瘟病毒UL1基因類型的分析與表達(dá)時(shí)相分析
            2.4.1 DPV UL1基因在病毒感染DEF細(xì)胞中的表達(dá)時(shí)相分析
            2.4.2 藥物抑制試驗(yàn)鑒定DPV UL1基因類型
        2.5 免疫熒光雙標(biāo)研究DPV UL1蛋白與gH蛋白的相互作用
            2.5.1 DPV UL1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.5.2 重組質(zhì)粒pCMV-HA-gH和pCMV-Myc-gL共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞
            2.5.3 免疫熒光雙標(biāo)
    3 試驗(yàn)結(jié)果
        3.1 生物信息學(xué)分析
            3.1.1 DPV UL1基因核酸序列分析
            3.1.2 DPV UL1蛋白氨基酸組分分析
            3.1.3 DPV UL1蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域
            3.1.4 DPV UL1蛋白氨基酸序列的多序列比對與進(jìn)化樹分析
            3.1.5 DPV UL1蛋白的信號肽預(yù)測
            3.1.6 DPV UL1蛋白的跨膜區(qū)預(yù)測
            3.1.7 DPV UL1蛋白功能位點(diǎn)預(yù)測
            3.1.8 DPV UL1蛋白疏水性分析
            3.1.9 DPV UL1蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測
            3.1.10 DPV UL1蛋白糖基化位點(diǎn)預(yù)測
            3.1.11 DPV UL1蛋白的B抗原表位分析
            3.1.12 DPV UL1蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測
            3.1.13 DPV UL1蛋白的亞細(xì)胞定位
            3.1.14 DPV UL1蛋白的密碼子偏嗜性分析
        3.2 鴨瘟病毒UL1基因克隆、原核表達(dá)、蛋白純化及多抗制備
            3.2.1 DPV UL1截段基因gLt的擴(kuò)增、T克隆及亞克隆的構(gòu)建
            3.2.2 重組原核質(zhì)粒pET32a(+)-gLt的表達(dá)條件優(yōu)化
            3.2.3 重組gLt蛋白的純化
            3.2.4 Western blot檢測gLt重組蛋白的反應(yīng)原性
            3.2.5 兔抗重組蛋白gLt血清的效價(jià)檢測以及純化
        3.3 鴨瘟病毒UL1蛋白在感染DEF內(nèi)的定位分析
            3.3.1 間接免疫熒光法檢測方法的條件優(yōu)化
            3.3.2 特異性檢測
            3.3.3 DPV UL1蛋白在病毒感染細(xì)胞中的動態(tài)分布
        3.4 鴨瘟病毒UL1基因類型的分析與表達(dá)時(shí)相分析
            3.4.1 DPV UL1基因在病毒感染細(xì)胞中的表達(dá)時(shí)相分析
            3.4.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA樣品的完整
            3.4.3 藥物抑制試驗(yàn)確定UL1基因類型
        3.5 免疫熒光雙標(biāo)研究DPV UL1蛋白與gH蛋白的相互作用
            3.5.1 真核表達(dá)載體pCMV-Myc-gL的鑒定
            3.5.2 DPV UL1蛋白與gH蛋白在HEK293細(xì)胞內(nèi)的共定位
    4 討論
        4.1 生物信息學(xué)分析
            4.1.1 DPV UL1基因及其編碼蛋白的分子特性
            4.1.2 DPV UL1基因編碼蛋白的遺傳特性和同源性
            4.1.3 DPV UL1基因密碼子偏嗜性研究
        4.2 鴨瘟病毒UL1基因克隆、原核表達(dá)、蛋白純化及多克隆抗體制備
        4.3 鴨瘟病毒UL1基因編碼蛋白在感染DEF內(nèi)的定位分析
        4.4 鴨瘟病毒UL1基因類型的分析與表達(dá)時(shí)相分析
        4.5 鴨瘟病毒UL1蛋白與gH蛋白在HEK293細(xì)胞內(nèi)的共定位
第三部分 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡介以及攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]致病性雞大腸桿菌pilA和外膜蛋白C原核誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化[J]. 水小溪,蔡樂,趙寶華.  河北師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2009(05)
[2]Dynamic changes of apoptosis in duck embryo fibroblasts induced by new type Gosling viral enteritis virus[J]. Shun Chen a,Anchun Cheng a,b,,Mingshu Wang a,b,Xiaoyue Chen a a Avian Disease Research Center,College of Veterinary Medicine of Sichuan Agricultural University,Yaan 625014,China b Key Laboratory of Animal Disease and Human Health of Sichuan Province,Yaan 625014,China.  Progress in Natural Science. 2008(02)
[3]密碼子偏性的分析方法及相關(guān)研究進(jìn)展[J]. 吳憲明,吳松鋒,任大明,朱云平,賀福初.  遺傳. 2007(04)
[4]蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究進(jìn)展[J]. 胡笳,郭燕婷,李艷梅.  科學(xué)通報(bào). 2005(11)
[5]大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力的影響因素[J]. 張嵐嵐,徐春燕,徐昌杰.  細(xì)胞生物學(xué)雜志. 2004(04)
[6]影響多重PCR擴(kuò)增效果的因素[J]. 黃銀花,胡曉湘,徐慰倬,高宇,馮繼東,孫漢,李寧.  遺傳. 2003(01)
[7]鴨病毒性腸炎病毒基因文庫的構(gòu)建及其核衣殼蛋白基因的發(fā)現(xiàn)、克隆與鑒定[J]. 程安春,汪銘書,文明,周偉光,郭宇飛,賈仁勇,徐超,袁桂萍,劉一塵.  高技術(shù)通訊. 2006 (09)

碩士論文
[1]鴨瘟病毒UL35基因的原核表達(dá)、蛋白純化、轉(zhuǎn)錄時(shí)相、表達(dá)時(shí)相及亞細(xì)胞定位[D]. 蔡銘升.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2009



本文編號：3448043