雞白痢沙門菌是宿主特異性致病菌,多侵害21日齡以內(nèi)的雛雞,引起白色痢疾,發(fā)病率和致死率極高;成年雞感染后一般無臨床癥狀,但使其處于持續(xù)帶菌狀態(tài),導(dǎo)致體重減輕,產(chǎn)蛋量下降。雞白痢沙門菌含有很多致病基因,其中ipaJ基因是在雞白痢沙門菌中新發(fā)現(xiàn)的與毒力相關(guān)的基因,其編碼的IpaJ蛋白參與細(xì)菌對機(jī)體的早期感染過程。研究表明ipaJ基因廣泛存在于雞白痢沙門菌中,且為雞白痢沙門菌血清型所特有的基因,與其親緣關(guān)系較近的其他血清型沙門菌則不含有該基因,如雞傷寒沙門菌和腸炎沙門菌等。本研究克隆表達(dá)了雞白痢沙門菌ipaJ基因,制備了 IpaJ蛋白的單克隆抗體并建立了相應(yīng)的檢測技術(shù),為雞白痢沙門菌致病機(jī)制的研究和疾病診斷提供了重要的生物學(xué)材料。1雞白痢沙門菌ipaJ基因的克隆及表達(dá)以雞白痢沙門菌C79-13和福氏志賀菌SNI基因組為模板分別PCR擴(kuò)增ipaJ基因。將ipaJ基因分別與原核表達(dá)載體pColdI和pMAL-c5X相連接構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒,通過雙酶切以及測序鑒定,結(jié)果表明ipaJ基因成功克隆至原核表達(dá)載體上,且沒有任何堿基突變。將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒分別命名為pColdI-SP-ipaJ（Sal... 

【文章來源】：揚(yáng)州大學(xué)江蘇省

【文章頁數(shù)】：74 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－３重組表達(dá)載體ｐＣｏｌｄＩ－ＳＰ－＿Ｊ酶切鑒

３．１．３?重組質(zhì)粒?ｐＣｏｌｄｌ－ＳＰ－中〇？／和?ｐＭＡＬ－ｃ５Ｘ－ＳＰ－＿／?的鑒定??將重組質(zhì)粒ｐＣｏｌｄＩ－ＳＰ－ｚ＞ａ／和ｐＭＡＬ－ｃ５Ｘ－ＳＰ－中〇／進(jìn)行雙酶切鑒定，經(jīng)瓊脂糖凝膠??電泳，在預(yù)期位置均出現(xiàn)中基因特異性條帶（如圖１－３，?１－４所示），將ＧｅｎＢａｎｋ中??矽〇７基因序列與測序結(jié)果進(jìn)行基因序列的Ｂｌａｓｔｎ比對，比對結(jié)果完全一致，表明??基因成功克隆至表達(dá)載體上。??Ｍ?１２?Ｍ?１?２?３??ｌ：ｌ：??圖１－３重組表達(dá)載體ｐＣｏｌｄＩ－ＳＰ－＿Ｊ酶切鑒圖１－４重組表達(dá)載體ＰＭＡＬ－ｃ５Ｘ－ＳＰ－＿Ｊ??定圖譜?酶切鑒定圖譜??Ｆｉｇ．?１－３?Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ?Ｆｉｇ．?１－４?Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ??ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｖｅｃｔｏｒ?ｐＣｏｉｄＩ－ＳＰ－；＞ｃ／Ｊ?ｂｙ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｖｅｃｔｏｒ?ｐＣｏｌｄｌ－ＳＰ－Ｚ／＾Ｊ?ｂｙ??ｗｉｔｈ?ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ?ｅｎｚｙｍｅ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ｗｉｔｈ?ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ?ｅｎｚｙｍｅ??Ｍ：?ＤＬ５０００?Ｍａｒｋｅｒ?Ｍ：?ＤＬ５０００?Ｍａｒｋｅｒ??１－２：?ｐＣｏｌｄＩ－ＳＰ－／＞ａｙ?１?－３：?ｐＭＡＬ－ｃ５Ｘ－ＳＰ－咖Ｊ??３．１．４重組質(zhì)粒卩＼１八１＾５乂－８？－中〇／的鑒定??將重組質(zhì)粒ｐＭＡＬ－ｃ５Ｘ－ＳＦ－＿Ｊ進(jìn)行雙酶切鑒定，經(jīng)１％瓊脂糖凝膠電泳，在預(yù)期??位置均出現(xiàn)中〇７基因特異性條帶（如圖１－５）

ＥＬＩＳＡ實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定檢測原蛋白ｒＭＢＰ－ＳＰ－ＩｐａＪ的最佳包被濃度是２ｎｇ／ｍＬ；免疫小??鼠血清的最佳稀釋度為１：３２００時(shí)ＯＤ４５〇吸光度值為０．９９８，經(jīng)分析最后確定將小鼠血??清１：３２００稀釋度作為檢測的陽性對照，圖２－１中小鼠血清稀釋梯度：從１：１００開始倍??比稀釋。??４－１??｜〇?｜．ｉｇ／ｍＬ??？?表?＊?Ｈｔｈ?８?ｕｇ／ｒｎＬ??３?Ｘ＼?６?Ｍｇ／ｍＬ??！?＼??ｊ２＊?？？祉??°?＋?１?郵ｍＬ??１－?－ａ－?０．５Ｍｇ／ｎｉＬ??Ａ?０．２５?ｐ．ｇ，／ｍＬ??０?????１００?２００?４００?８００?１６００?３２００?６４００??圖２－１方陣實(shí)驗(yàn)確定抗原最佳包被濃度??Ｆｉｇ．?２－１?Ｄｅｔｅｍｉｉｎａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｒＭＢＰ－ＳＰ－ＩｐａＪ?ｏｐｔｉｍａｌ?ｗｏｒｋｉｎｇ?ｃｏｎｃｅｒｎｔｒａｔｉｏｎ??３．２陽性雜交瘤細(xì)胞株的建立??細(xì)胞融合成功后，利用３．１建立的間接ＥＬＩＳＡ檢測方法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞株，??并對雜交瘤細(xì)胞連續(xù)進(jìn)行２次亞克隆，最終獲得８株穩(wěn)定分泌雞白痢沙門菌ＩｐａＪ特??異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]雞白痢沙門氏菌膠體金免疫層析快速檢測試紙條的研制及初步應(yīng)用[J]. 劉志科,楊寧寧,徐明國,荊明龍,曹旭東,陳創(chuàng)夫.  河南科技學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2018(01)
[2]雞白痢沙門菌研究進(jìn)展[J]. 殷俊磊,李求春,耿士忠,潘志明,焦新安.  中國獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2016(09)
[3]肉雞產(chǎn)業(yè)鏈中沙門菌流行情況及其耐藥性[J]. 謝懋英,賴婧,馬立才,吳聰明,左之才.  中國獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2014(11)
[4]雞白痢的診斷與防治[J]. 范志炎.  畜牧與飼料科學(xué). 2013(Z1)
[5]雞白痢沙門氏菌的分離與鑒定[J]. 安輝,張大華,陳小玲,徐福洲,賀云霞,黃秀芬,李桂萍,孫惠玲.  安徽農(nóng)業(yè)科學(xué). 2011(32)
[6]免疫磁珠技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 于露,孫秀蘭.  糧食與油脂. 2011(10)
[7]雞白痢沙門菌ipaJ基因的克隆與鑒定[J]. 李求春,徐耀輝,黃金林,焦新安.  微生物學(xué)報(bào). 2010(11)
[8]膠體金免疫層析法檢測豬PRVgE抗體方法的建立及應(yīng)用[J]. 白靜,于新和,邊傳周.  河南科技學(xué)院學(xué)報(bào). 2009(01)
[9]雞白痢沙門菌基因組差異片段的篩選與分析[J]. 徐耀輝,焦新安,李求春,潘志明,黃金林.  中國獸醫(yī)科學(xué). 2007(07)
[10]雞白痢和腸炎沙門氏菌抑制差減文庫的構(gòu)建與分析[J]. 李求春,焦新安,徐耀輝,潘志明,黃金林.  揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版). 2007(01)

碩士論文
[1]我國部分地區(qū)雞白痢沙門菌耐藥性與耐藥基因分析[D]. 李秀.揚(yáng)州大學(xué) 2016



本文編號：3447284