發(fā)布時間：2021-10-20 16:38

　　羊傳染性膿皰�。∣rf）由羊口瘡病毒（Orf Virus，ORFV）引起，是世界范圍內(nèi)危害養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展的人畜共患疾病之一。ORFV不僅能引起小型反芻動物和部分野生動物感染，還可能污染環(huán)境，造成與受污染環(huán)境密切接觸的人員感染發(fā)病。目前，一般采用ORFV滅活苗或弱毒苗接種，但效果并不理想，有時會出現(xiàn)免疫羊感染ORFV的情況。由于細(xì)胞免疫應(yīng)答是ORFV引起宿主的主要免疫類型，因此，研制T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位組合的多表位基因工程疫苗，能夠強(qiáng)化細(xì)胞免疫途徑以及激活高效的體液免疫應(yīng)答途徑，對Orf的防控將有重要的應(yīng)用價值。本研究在黑龍江大慶地區(qū)發(fā)現(xiàn)Orf疑似病例，通過病原分離、病毒形態(tài)學(xué)觀察、間接免疫熒光檢測（IFA）、DNA序列和氨基酸序列比對、家兔和小鼠的感染試驗以及回歸動物試驗等，最終確定獲得一株ORFV，命名為OV/HLJ/04。流行株之間遺傳關(guān)系分析證明OV/HLJ/04與2011年山西株（HQ221964）之間遺傳關(guān)系密切。此外，基于B2L基因的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹表明OV/HLJ/04應(yīng)當(dāng)歸類于基因Ⅲ型ORFV。繼而，本研究選擇ORFV的囊膜蛋白B2L基因為靶基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體，將表達(dá)產(chǎn)... 

【文章來源】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)黑龍江省

【文章頁數(shù)】：76 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
目錄
CONTENTS
英文縮略表
第一章 文章綜述
    1.1 引言
    1.2 羊口瘡病毒研究進(jìn)展
        1.2.1 病原學(xué)及其分類
        1.2.2 病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)
        1.2.3 病毒的基因組結(jié)構(gòu)
        1.2.4 毒力因子
        1.2.5 ORFV 的研究展望
    1.3 蛋白 B2L 的研究進(jìn)展
    1.4 表位研究方法
    1.5 目的與意義
第二章 羊口瘡病毒的分離鑒定
    2.1 材料
        2.1.1 病料來源、細(xì)胞和實驗動物
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要器材
    2.2 方法
        2.2.1 病毒分離
        2.2.2 分離株的鑒定
            2.2.2.1 電鏡觀察
            2.2.2.2 間接免疫熒光檢測（IFA）
            2.2.2.3 PCR 鑒定
            2.2.2.4 TCID50 測定
            2.2.2.5 家兔小鼠的攻毒實驗
            2.2.2.6 動物回歸試驗
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 病原體電鏡觀察結(jié)果
        2.3.2 間接免疫熒光檢測（IFA）
        2.3.3 TCID50 測定
        2.3.4 家兔小鼠的攻毒實驗
        2.3.5 回歸實驗
        2.3.6 B2L 和 F1L 基因鑒定及進(jìn)化分析結(jié)果
第三章 單克隆抗體的制備
    3.1 材料
        3.1.1 細(xì)胞、細(xì)菌和實驗動物
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 主要儀器設(shè)備和耗材
    3.2 方法
        3.2.1 蛋白 B2L 的表達(dá)與純化
        3.2.2 免疫小鼠
        3.2.3 間接 ELISA 方法檢測抗體效價
        3.2.4 雜交瘤細(xì)胞株的建立
        3.2.5 陽性雜交瘤細(xì)胞株的篩選
        3.2.6 陽性雜交瘤細(xì)胞的克隆化
        3.2.7 雜交瘤細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇
        3.2.8 單克隆抗體的大量制備及初步純化
        3.2.9 雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清及初步純化單抗 4E2 的效價測定
        3.2.10 4E2 的純化及濃度的測定
        3.2.11 2E4 生物學(xué)活性鑒定
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 蛋白 B2L 的誘導(dǎo)表達(dá)、純化結(jié)果
        3.3.2 抗原和血清最佳工作濃度的確立
        3.3.3 小鼠免疫血清抗體效價檢測
        3.3.4 細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的篩選
        3.3.5 單抗的大量制備及初步純化
        3.3.6 2E4 效價的測定
        3.3.7 2E4 特異性鑒定
第四章 中和試驗和免疫熒光實驗
    4.1 材料
        4.1.1 毒株、細(xì)胞和動物
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 主要儀器
    4.2 方法
        4.2.1 2E4 的中和試驗
        4.2.2 間接免疫熒光實驗
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 中和試驗
        4.3.2 免疫熒光檢測 ORFV 在感染細(xì)胞內(nèi)的分布情況
第五章 討論
    5.1 羊口瘡病毒的分離鑒定
    5.2 單克隆抗體的制備
    5.3 中和試驗和免疫熒光實驗
第六章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
附錄
個人簡歷


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]羊口瘡病毒黑龍江省分離株的分離鑒定[J]. 于永忠,譚強(qiáng),趙文博,包凱,崔玉東.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報. 2013(08)
[2]羊胚胎鼻甲細(xì)胞的原代培養(yǎng)及其在羊口瘡病毒研究中的應(yīng)用[J]. 汪園園,童雙,李威,高豐,寧章勇,羅樹紅.  中國獸醫(yī)科學(xué). 2013(05)
[3]新疆羊口瘡病毒分離鑒定及B2L基因分析與表達(dá)[J]. 李瑞芳,李國華,孟仁,喬軍,張輝,陳創(chuàng)夫.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報. 2013(03)
[4]羊口瘡病毒分子生物學(xué)的研究進(jìn)展[J]. 閆豐超,邵佳,竇永喜.  中國獸醫(yī)科學(xué). 2013(01)
[5]羊口瘡病毒農(nóng)安分離株的分離鑒定及Orf059（F1L）基因的序列分析[J]. 蘇高莉,趙魁,孫秀萍,何葉,周平,潘偉,包英夫,李吉達(dá),宋德光,高豐.  中國獸醫(yī)學(xué)報. 2013(01)
[6]湖北省羊口瘡病毒的分離鑒定[J]. 王光祥,尚佑軍,陳江濤,呂占祿,張克山,劉湘濤.  動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2012(11)
[7]羊口瘡病毒B2L蛋白二級結(jié)構(gòu)及其細(xì)胞表位的預(yù)測[J]. 王光祥,尚佑軍,呂占祿,田宏,張克山,劉湘濤.  中國獸醫(yī)科學(xué). 2012(11)
[8]羊口瘡病毒分子特征與免疫逃逸策略[J]. 于永忠,吳志軍,朱戰(zhàn)波,潘求真,崔玉東.  病毒學(xué)報. 2012(03)
[9]貴州地區(qū)羊口瘡病毒B2L基因克隆及原核表達(dá)載體構(gòu)建[J]. 向智龍,卓建華,程振濤,歐德淵,鮮思美,尹傳寶,黃璐,禾彩紅.  中國畜牧獸醫(yī). 2011(07)
[10]抗原表位研究方法進(jìn)展[J]. 宋帥,李春玲,賈愛卿,楊冬霞,李淼.  動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2010(12)

博士論文
[1]羊傳染性膿皰病毒重組DNA疫苗的構(gòu)建與實驗免疫研究[D]. 趙魁.吉林大學(xué) 2010

碩士論文
[1]抗S.aureus TRAP蛋白單克隆抗體的制備及其抗原表位分析[D]. 周雪.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 2012
[2]羊傳染性膿皰病毒感染羔羊細(xì)胞免疫應(yīng)答變化規(guī)律的研究[D]. 張冰冰.吉林大學(xué) 2011
[3]藍(lán)舌病病毒VP7蛋白的原核表達(dá)及單克隆抗體的制備[D]. 李文超.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2007
[4]羊傳染性膿皰病毒生物學(xué)特性及PCR檢測方法的研究[D]. 羅云.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 2006
[5]抗狂犬病病毒單克隆抗體的制備及應(yīng)用研究[D]. 曹亮.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 2005



本文編號：3447249