細胞蛋白 NOP53,又稱 PICT-1（protein interacting with carboxy1 terminus 1）,由膠質(zhì)瘤抑制候選基因 2（glioma tumor suppressor candidate region gene 2,GLTSCR2）編碼。在多種腫瘤細胞中,NOP53表達下調(diào)甚至消失。NOP53上存在多個核定位信號;核糖體應激時,NOP53從細胞核仁易位到核質(zhì)中。NOP53能夠與多種細胞蛋白及病毒蛋白相互作用。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)細胞蛋白NOP53能夠特異性去除視磺酸誘導基因I（retinoic acid inducible gene-I,RIG-I）K63位泛素化鏈,從而抑制RIG-I活化,阻斷Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。目的意義:本研究從細胞蛋白NOP53的表達與定位入手,研究病毒劫持NOP53以利于自身復制的機制,為揭示病毒-細胞互作機理提供重要的科學資料,同時為設(shè)計抗病毒蛋白類廣譜抑制劑提供新思路。方法:（1）以單純皰疹病毒Ⅰ型（herpes simplex virus1,HSV-1）作為模式病毒,通過RT-PCR、免疫印跡、空斑實驗等試驗研究過表達... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)大學北京市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：130 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

圖２－１．?ＨｅＬａ細胞中，過表達ＮＯＰ５３促進ＨＳＶ－ｌ／Ｆ復制??在ＨｅＬａ細胞中轉(zhuǎn)染Ｆｌａｇ空載（Ｃｔｒｌ）、Ｆｌａｇ－ＮＯＰ５３?（ＮＯＰ）或Ｆｌａｇ－Ｎ４?（Ｎ４）真核表達質(zhì)粒３６ｈ后，??

（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ?ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ?ｖｉｒｕｓ，?ＶＳＶ）復制。為了驗證?Ｎ４?在?ＨＳＶ－１／Ｆ?復制中的作用，在?ＨｅＬａ?細??胞中轉(zhuǎn)染Ｆｌａｇ－Ｎ４，發(fā)現(xiàn)過表達Ｎ４也能夠上調(diào)ＨＳＶ－ＩＣＰ８?ｍＲＮＡ水平，且在病毒感染６及】２?ｈ??與對照組有顯著差異，在病毒感染２４?＾與對照組有極顯著差異（如圖２－１Ａ）。免疫印跡試驗表??明過表達Ｎ４能夠上調(diào)ＨＳＶ－ＩＣＰ８蛋白水平（如圖２－１Ｂ）。最后，如圖２－１Ｃ，病毒感染３６ｈ，??過表達Ｎ４組病毒滴度較對照組提升３１倍；病毒感染４８?ｈ，過表達ＮＯＰ５３組病毒滴度較對照??組提升４２倍。上述結(jié)果表明，過表達ＮＯＰ５３羧基末端截短體Ｎ４也能夠促進ＨＳＶ－丨／Ｆ復制，??且其作用與ＮＯＰ５３全長相當。??２．３．２基因沉默細胞蛋白ＮＯＰ５３對ＩＩＳＶ－１／Ｆ在Ｉｌｅｌａ細胞中復制的影口向??利用小干擾ＲＮＡ技術(shù)，研宄ＮＯＰ５３基因沉默對ＨＳＶ－１／Ｆ在Ｈｅｌａ細胞中復制的影響。在??ＨｅＬａ?細胞中轉(zhuǎn)染?ｓｉＮｅｇ?或?ｓｉＮＯＰ５３，?７２?ｈ?后，使用?ＨＳＶ－１／Ｆ?（０．１?ＭＯＩ）感染細胞?３、６、１２、??２４ｈ，提取細胞總ＲＮＡ，進行ＲＴ－ＰＣＲ，檢測病毒丨ＣＰ８ｍＲＮＡ水平。如圖２－２Ａ，可以發(fā)現(xiàn)基??因沉默ＮＯＰ５３可下調(diào)ＨＳＶ－ＩＣＰ８?ｍＲＮＡ水平且在病毒感染丨２及２４?ｌｉ與對照組有極顯著差異。??在ＨｅＬａ細胞中基因沉默ＮＯＰ５３，使用ＨＳＶ－１／Ｆ?（０．１?ＭＯＩ）感染細胞３６ｈ，提取細胞蛋白進行??免疫印跡試驗。如圖２－２Ｂ

ＩＦＮ－ｃｃ／ｐ［３Ｓ］）進行試驗。在Ｖｅｒｏ細胞中轉(zhuǎn)染Ｆｌａｇ空載體或Ｆｌａｇ－ＮＯＰ５３真核表達質(zhì)粒，使用??ＨＳＶ－１／Ｆ?（０．１?ＭＯＩ）感染細胞３６或４８丨１。免疫印跡試驗結(jié)果顯示，過表達ＮＯＰ５３能夠上調(diào)??ＨＳＶ－ＩＣＰ８蛋白水平（如圖２－３Ａ）。為了進一步研宄過表達ＮＯＰ５３對ＨＳＶ－１／Ｆ在Ｖｅｒｏ細胞中復??制的影響，使用ＨＳＶ－ｌ／Ｆ?（１?ＭＯＩ）感染過表達Ｆｌａｇ空載或ｎａｇ－ＮＯＰ５３的Ｖｅｒｏ細胞，分別收??集細胞上清（Ｅｘｔｒａｃｅｌｈ丨丨ａｒ）及細胞沉淀（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）中病毒進行空斑實驗。發(fā)現(xiàn)病毒感染３６??及４８?ｈ，過表達ＮＯＰ５３組上清中病毒滴度較對照組分別提升１４．７倍及１２．６倍（如圖２－３Ｂ）。??病毒感染３６及４８?ｈ，過表達ＮＯＰ５３組細胞沉淀中病毒滴度較對照組分別提升丨４．３倍及］３．６??倍（如圖２－３Ｃ）。丨：述結(jié)果表明，在Ｖｅｒｏ細胞中，過表達ＮＯＰ５３依然能夠促進ＨＳＶ－１／Ｆ復制。??另外，在Ｖｅｒｏ細胞中轉(zhuǎn)染Ｆ］ａｇ－Ｎ４進行免疫印跡試驗，發(fā)現(xiàn)過表達Ｎ４能夠上調(diào)ＨＳＶ－ＴＣＰ８??蛋白水平（如圖２－３Ａ）。病毒感染３６及４８?ｈ，過表達Ｎ４組上清中病毒滴度較對照組分別提升??１０．６倍及丨２．６倍（如圖２－３Ｂ）。病毒感染３６及４８?ｈ，過表達Ｎ４組細胞沉淀中病毒滴度較對照??組分別提升８．８倍及８．９倍（如圖２－３Ｃ）。上述結(jié)果表明

【參考文獻】：
期刊論文
[1]Effects of Nigella sativa on outcome of hepatitis C in Egypt[J]. Eman Mahmoud Fathy Barakat,Lamia Mohamed El Wakeel,Radwa Samir Hagag.  World Journal of Gastroenterology. 2013(16)
[2]腫瘤抑制基因PTEN的研究進展[J]. 周雋.  癌變.畸變.突變. 2002(02)

博士論文
[1]GLTSCR2負調(diào)控Ⅰ型干擾素及抗病毒應答的分子機制[D]. 王鵬.中國農(nóng)業(yè)大學 2017
[2]核仁蛋白PICT-1在核糖體應激下對MDM2-P53信號通路及腫瘤細胞生長的影響及其分子機制[D]. 宋瓏.中南大學 2011



本文編號：3434530