本文關(guān)鍵詞：抑制表皮葡萄球菌生物膜形成的放線菌篩選及其作用機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：在奶牛養(yǎng)殖生產(chǎn)實踐中,表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis,S.epidermidis)是引起奶牛隱性乳房炎的重要條件致病菌之一。由表皮葡萄球菌及其他凝固酶陰性葡萄球菌(Coagulase Negative Staphylococci,CNS)形成的生物膜結(jié)構(gòu),能夠增強致病菌在乳腺上皮細胞表面的黏附定植能力,促使致病菌不斷向外界釋放毒力因子。生物膜為膜內(nèi)致病菌提供保護屏障,阻礙藥物與細胞作用靶點結(jié)合,最終造成了奶牛乳房炎反復(fù)發(fā)作難以治愈的現(xiàn)狀。因此,新型生物膜抑制劑的研發(fā)逐漸成為預(yù)防獸醫(yī)領(lǐng)域的研究熱點。放線菌能夠產(chǎn)生豐富的代謝產(chǎn)物,是挖掘生物活性物質(zhì)的天然寶庫。從放線菌中分離獲得新型生物膜抑制劑,在奶牛乳房炎的防治及新藥研發(fā)中具有重大應(yīng)用價值。本論文以分離自新疆南疆鹽堿地區(qū)土壤的185株放線菌為研究對象,采用微量板半定量法篩選獲得3株具有抑制表皮葡萄球菌5-121-2及ATCC 35984生物膜形成的活性菌株,分別是擬諾卡氏菌屬(TRM46200),鏈霉菌屬(TRM41337)和糖單孢菌屬(TRM46814)。采用顯微鏡觀察經(jīng)3株放線菌發(fā)酵液處理后的表皮葡萄球菌生物膜在固相載體表面附著能力的明顯下降,發(fā)現(xiàn)經(jīng)蛋白酶K及加熱處理后,發(fā)酵液抑制生物膜活性明顯減弱或喪失。采用硫酸銨沉淀法獲得放線菌發(fā)酵液粗蛋白,并對其進行相關(guān)抑制生物膜形成活性測定。采用細菌黏附碳氫化合物法(Bacterial Adhesion to Hydrocarbon,BATH)檢測經(jīng)3株放線菌發(fā)酵液蛋白處理前后2株表皮葡萄球菌細胞表面疏水性(Cell Surface Hydrophobicity,CSH)明顯降低,而細胞表面疏水性介導(dǎo)了胞間黏附,一旦細胞表面疏水性降低,將會影響致病菌與致病菌、致病菌與宿主之間的非特異性黏附,從而導(dǎo)致生物膜形成受阻。3株放線菌發(fā)酵液蛋白的抑制活性在細菌生物膜形成的初始黏附時期及聚集時期均發(fā)揮著明顯的作用。采用高碘酸鈉、α-淀粉酶、β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、蛋白酶K和DNase I分別處理表皮葡萄球菌5-121-2及ATCC 35984生物膜。結(jié)果表明高碘酸鈉能夠有效地破壞表皮葡萄球菌ATCC 35984生物膜結(jié)構(gòu),而其他處理組對其作用效果不明顯,說明其生物膜主要由還原性胞外多糖組成。表皮葡萄球菌5-121-2經(jīng)α-淀粉酶、β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、蛋白酶K和DNase I處理后,生物膜結(jié)構(gòu)被破壞,而高碘酸鈉對其作用效果不明顯,說明表皮葡萄球菌5-121-2生物膜中非還原性胞外多糖、胞外蛋白及胞外DNA同時參與其生物膜結(jié)構(gòu)的組成。采用瓊脂糖凝膠電泳和柱前衍生高效液相色譜法分別檢測經(jīng)3株放線菌發(fā)酵液蛋白處理后2株表皮葡萄球菌生物膜內(nèi)胞外DNA及胞外多糖變化情況。發(fā)現(xiàn)經(jīng)處理后的表皮葡萄球菌的胞外多糖單糖組分種類及相對摩爾比例均發(fā)生改變,胞外DNA均被降解。說明放線菌發(fā)酵液蛋白主要通過改變細菌生物膜成分,而實現(xiàn)其生物學(xué)活性。最后,分別檢測2株表皮葡萄球菌對青霉素、鏈霉素和土霉素敏感性。結(jié)果表明,標準菌株ATCC35984和臨床菌株5-121-2對鏈霉素表現(xiàn)一定的耐受性,說明生物膜在某種程度上增加了致病菌對抗生素的耐藥性。采用棋盤法檢測放線菌發(fā)酵液蛋白與鏈霉素體外聯(lián)合抑制表皮葡萄球菌的效果,結(jié)果表明,獲得的協(xié)同作用效果最明顯組合中,抗生素與發(fā)酵液蛋白聯(lián)用時的有效使用劑量均明顯低于單獨使用劑量。說明發(fā)酵液蛋白抑制表皮葡萄球菌生物膜形成的同時,提高了對抗生素的敏感性。本研究目的在于充分利用新疆豐富的放線菌資源,篩選出放線菌源無毒、高效抑制生物膜的活性物質(zhì),并研究其對引起奶牛隱性乳房炎的表皮葡萄球菌生物膜形成機制造成的影響,為表皮葡萄球菌生物膜感染相關(guān)疾病的防治提供實驗依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：奶牛乳房炎 表皮葡萄球菌 生物膜 放線菌 發(fā)酵液蛋白
【學(xué)位授予單位】：塔里木大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.23
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第1章 文獻綜述11-20
• 1.1 表皮葡萄球菌生物膜與感染相關(guān)研究進展11-14
• 1.2 表皮葡萄球菌生物膜與細菌耐藥性相關(guān)研究進展14-15
• 1.3 表皮葡萄球菌生物膜防治相關(guān)研究進展15-19
• 1.4 論文設(shè)計思路19-20
• 1.4.1 研究目的及意義19
• 1.4.2 技術(shù)路線19-20
• 第2章 抑制表皮葡萄球菌生物膜形成的放線菌篩選20-28
• 2.1 材料20-21
• 2.1.1 實驗菌株20-21
• 2.1.2 培養(yǎng)基21
• 2.1.3 實驗儀器21
• 2.2 方法21-23
• 2.2.1 放線菌菌株活化及發(fā)酵21-22
• 2.2.2 放線菌發(fā)酵液對表皮葡萄球菌生物膜形成的影響22
• 2.2.3 放線菌發(fā)酵液對表皮葡萄球菌生物膜結(jié)構(gòu)的影響22
• 2.2.4 放線菌發(fā)酵液抑制表皮葡萄球菌生物膜形成活性穩(wěn)定性分析22-23
• 2.3 結(jié)果與分析23-26
• 2.3.1 具有抑制生物膜形成活性的放線菌篩選23-24
• 2.3.2 放線菌對表皮葡萄球菌生物膜結(jié)構(gòu)影響24-25
• 2.3.3 放線菌發(fā)酵液抑制表皮葡萄球菌生物膜形成活性穩(wěn)定性分析25-26
• 2.4 討論26-28
• 第3章 抑制表皮葡萄球菌生物膜形成放線菌發(fā)酵液蛋白的分離及活性檢測28-43
• 3.1 材料28-29
• 3.1.1 實驗菌株28-29
• 3.1.2 培養(yǎng)基及溶液29
• 3.1.3 實驗儀器29
• 3.2 方法29-33
• 3.2.1 放線菌菌株活化及發(fā)酵29
• 3.2.2 放線菌發(fā)酵液蛋白的提取29-30
• 3.2.3 放線菌發(fā)酵液蛋白對表皮葡萄球菌生物膜形成的影響30
• 3.2.4 放線菌發(fā)酵液蛋白對表皮葡萄球菌生物膜形成不同階段的影響30
• 3.2.5 放線菌發(fā)酵液蛋白對表皮葡萄球菌細胞表面疏水性的影響30-31
• 3.2.6 放線菌發(fā)酵液蛋白對表皮葡萄球菌胞外DNA的影響31
• 3.2.7 表皮葡萄球菌 51212 及ATCC 35984生物膜形成依賴型檢測31-32
• 3.2.8 放線菌發(fā)酵液蛋白對表皮葡萄球菌胞外多糖的影響32-33
• 3.3 結(jié)果與分析33-40
• 3.3.1 放線菌發(fā)酵液蛋白對表皮葡萄球菌生物膜形成的影響33-34
• 3.3.2 放線菌發(fā)酵液蛋白對表皮葡萄球菌生物膜不同形成階段的影響34-35
• 3.3.3 放線菌發(fā)酵液蛋白對表皮葡萄球菌細胞表面疏水性的影響35-36
• 3.3.4 表皮葡萄球菌 51212 及ATCC 35984生物膜形成依賴型檢測36-37
• 3.3.5 放線菌發(fā)酵液蛋白對表皮葡萄球菌胞外DNA的影響37-38
• 3.3.6 放線菌發(fā)酵液蛋白對表皮葡萄球菌胞外多糖的影響38-40
• 3.4 討論40-43
• 第4章 放線菌發(fā)酵液蛋白與抗生素藥物體外聯(lián)合作用表皮葡萄球菌的抑菌活性研究43-51
• 4.1 材料43
• 4.1.1 實驗菌株43
• 4.1.2 主要試驗試劑43
• 4.1.3 實驗儀器43
• 4.2 方法43-45
• 4.2.1 抗生素作用表皮葡萄球菌最低抑菌濃度測定43-44
• 4.2.2 放線菌發(fā)酵液蛋白與抗生素藥物體外聯(lián)合作用表皮葡萄球菌的抑菌效果測定44-45
• 4.2.3 放線菌發(fā)酵液蛋白與抗生素藥物體外聯(lián)合作用表皮葡萄球菌的抑菌效果評價45
• 4.3 結(jié)果與分析45-50
• 4.3.1 抗生素作用表皮葡萄球菌最低抑菌濃度（MIC）測定45-46
• 4.3.2 放線菌發(fā)酵液蛋白與抗生素藥物體外聯(lián)合作用表皮葡萄球菌的抑菌效果評價46-50
• 4.4 討論50-51
• 第5章 總結(jié)與展望51-53
• 參考文獻53-58
• 致謝58-59
• 作者簡介59-60
• 附錄60-63

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本文編號：343275