近年來的研究證實,miRNAs在哺乳動物毛色生成過程中發(fā)揮著重要作用。Targetscan7.1、miRDB和miRBase等生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-100-5p與FGF21存在靶結(jié)合位點。目前,關(guān)于miR-100-5p與FGF21調(diào)控羊駝黑色素細胞中黑色素生成的研究尚未報道。為了探索miR-100-5p與FGF21對羊駝黑色素細胞色素生成的調(diào)控作用,本實驗如下:構(gòu)建pmirGLO-FGF21 3’UTR載體并進行雙熒光檢測,FGF21真核表達載體、FGF21-siRNA、miR-100-5p真核表達載體分別轉(zhuǎn)染至羊駝黑色素細胞,檢測轉(zhuǎn)染后羊駝黑色素細胞中黑色素含量的變化,檢測相關(guān)毛色基因FGF21、P-ERK、MITF、TYR、TYRP2在mRNA及蛋白水平的變化。實驗結(jié)果如下:（1）羊駝黑色素細胞中轉(zhuǎn)染FGF21真核表達載體,以深入研究FGF21對黑色素生成的影響。黑色素含量測定結(jié)果顯示:FGF21轉(zhuǎn)染后,黑色素含量顯著下降。qRT-PCR結(jié)果顯示:FGF21轉(zhuǎn)染后,MITF、TYR、TYRP2及ERK1/2的mRNA相對表達量顯著下降。免疫印跡結(jié)果分析顯示:FGF21轉(zhuǎn)染后,M... 

【文章來源】：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)山西省

【文章頁數(shù)】：54 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖３－１?ＦＧＦ２１?ＰＣＲ擴增產(chǎn)物??－

３．３?ＦＧＦ２１真核表達載體構(gòu)建及驗證??羊駝ＦＧＦ２１基因與ＰＭＳＣＶ表達載體連接后，初步進行菌液ＰＣＲ驗證連接是否成??功。菌液ＰＣＲ獲得單一的明亮條帶，片段大小約６３０?ｂｐ?（圖３－３）。華大基因測序結(jié)果??顯示ｐＭＳＣＶ表達載體上含有基因ＦＧＦ２１的ＣＤＳ區(qū)，即ｐＭＳＣＶ－ＦＧＦ２１重組質(zhì)粒構(gòu)建??成功。??２０００??２００??ＵＫ）?Ｉ??圖３－３?ｐＭＳＣ－ＦＧＦ２１表達載體菌液ＰＣＲ驗證??Ｆｉｇ．３－３?Ｂａｃｔｅｒｉａｌ?ｌｉｑｕｉｄ?ＰＣＲ?ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｐＭＳＣＶ－ＦＧＦ２１?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｖｅｃｔｏｒ??３．４?ＦＧＦ２１和ＦＧＦ２１－ｓｉＲＮＡ轉(zhuǎn)染羊駝黑色素細胞的效率??熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后細胞的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)羊駝黑色素細胞中有大量的綠色熒??光蛋白表達，表明ｐＭＳＣＶ空載組和ｐＭＳＣＶ－ＦＧＦ２１實驗組、ＮＣ對照組和ＦＧＦ２１－ｓｉＲＮＡ??實驗組成功轉(zhuǎn)染至細胞內(nèi)。ｑＲＴ－ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔ結(jié)果顯示ｐＭＳＣＶ－ＦＧＦ２１轉(zhuǎn)染組中??ＦＧＦ２１的ｍＲＮＡ和蛋白表達量均顯著提高（尸＜０．０１）（圖３．４?Ａ），而ＦＧＦ２卜ｓｉＲＮＡ轉(zhuǎn)??染中ＦＧＦ２１的ｍＲＮＡ和蛋白表達量均顯著下降（Ｐ＜０．０１?）（圖３．４?Ｂ）。??－２１?－??

圖３－２ＦＧＦ２１克隆載體雙酶切驗證??Ｆｉｇ．３－２?Ｄｕｂｌｅ?ｅｎｚｙｍｅ－ｄｉｇｅｓｔｅｄ?ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＦＧＦ２１?ｃｌｏｎｉｎｇ?ｖｅｃｔｏｒ??３．３?ＦＧＦ２１真核表達載體構(gòu)建及驗證??羊駝ＦＧＦ２１基因與ＰＭＳＣＶ表達載體連接后，初步進行菌液ＰＣＲ驗證連接是否成??功。菌液ＰＣＲ獲得單一的明亮條帶，片段大小約６３０?ｂｐ?（圖３－３）。華大基因測序結(jié)果??顯示ｐＭＳＣＶ表達載體上含有基因ＦＧＦ２１的ＣＤＳ區(qū)，即ｐＭＳＣＶ－ＦＧＦ２１重組質(zhì)粒構(gòu)建??成功。??２０００??２００??ＵＫ）?Ｉ??圖３－３?ｐＭＳＣ－ＦＧＦ２１表達載體菌液ＰＣＲ驗證??Ｆｉｇ．３－３?Ｂａｃｔｅｒｉａｌ?ｌｉｑｕｉｄ?ＰＣＲ?ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｐＭＳＣＶ－ＦＧＦ２１?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｖｅｃｔｏｒ??３．４?ＦＧＦ２１和ＦＧＦ２１－ｓｉＲＮＡ轉(zhuǎn)染羊駝黑色素細胞的效率??熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后細胞的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)羊駝黑色素細胞中有大量的綠色熒??光蛋白表達，表明ｐＭＳＣＶ空載組和ｐＭＳＣＶ－ＦＧＦ２１實驗組、ＮＣ對照組和ＦＧＦ２１－ｓｉＲＮＡ??實驗組成功轉(zhuǎn)染至細胞內(nèi)。ｑＲＴ－ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔ結(jié)果顯示ｐＭＳＣＶ－ＦＧＦ２１轉(zhuǎn)染組中??ＦＧＦ２１的ｍＲＮＡ和蛋白表達量均顯著提高（尸＜０．０１）（圖３．４?Ａ），而ＦＧＦ２卜ｓｉＲＮＡ轉(zhuǎn)??染中ＦＧＦ２１的ｍＲＮＡ和蛋白表達量均顯著下降（Ｐ＜０．０１?）（圖３．４?Ｂ）。??－２１?－??

【參考文獻】：
期刊論文
[1]刺蒺藜對小鼠毛囊黑素細胞刺激素表達的影響[J]. 楊柳,路建偉,安靚,姜萱.  南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報. 2006(12)

博士論文
[1]不同毛色羊駝皮膚microRNAs的全基因組表達譜分析和功能研究[D]. 田雪.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013

碩士論文
[1]甌江彩鯉“全紅”與“粉玉”群體基因組掃描分析紅、白體色的遺傳機制以及鯉魚FGF基因家族研究[D]. 蔣立坤.上海海洋大學(xué) 2016



本文編號：3431436