本文關(guān)鍵詞：牛精原干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和組蛋白H3K9三甲基化修飾研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：精原干細(xì)胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是哺乳動(dòng)物體內(nèi)唯一能持續(xù)批量更新并將基因傳至子代的天然多能性成體干細(xì)胞,其在干細(xì)胞生物學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究、畜牧業(yè)生產(chǎn)以及瀕危動(dòng)物保護(hù)等方面有廣闊的應(yīng)用前景。小型嚙齒類和人SSCs的體外培養(yǎng)、鑒定及發(fā)育機(jī)制等方面的研究已取得顯著進(jìn)展,但有關(guān)大家畜特別是牛SSCs的研究仍存在很多問題,如取材不便、特異性標(biāo)記有爭(zhēng)議、培養(yǎng)體系不成熟、干細(xì)胞特性難以維持等。針對(duì)以上問題,本次研究首先對(duì)牛睪丸組織的冷凍保存、特導(dǎo)性分子標(biāo)記篩選及分離富集方法進(jìn)行了探究。結(jié)果顯示,血清替代物(knockout serum replacer,KSR)可以替代胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)用于牛睪丸組織的凍存,組織復(fù)蘇后結(jié)構(gòu)完整、清晰;熒光定量PCR和免疫熒光染色結(jié)果表明,GFRα-1可以作為牛SSCs的標(biāo)志物;制備牛睪丸生精上皮細(xì)胞懸液后,進(jìn)行牛精原干細(xì)胞的富集,發(fā)現(xiàn)聯(lián)合使用差異貼壁法和Percoll密度梯度離心法可以有效提升牛SSCs的富集度。本次實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討了基于小分子抑制劑(2i)的培養(yǎng)體系對(duì)牛SSCs干性的維持效果。熒光定量PCR分析顯示,2i培養(yǎng)條件能顯著上調(diào)多能性基因(Oct4,Sox2,Nanog)、SSCs標(biāo)記基因(Gfrα-1,Plzf)、抗凋亡基因(Bcl2)以及白血病抑制因子受體基因(LIFR)的表達(dá),并抑制精原細(xì)胞分化標(biāo)志基因(c-kit)和促凋亡基因(Bax)的表達(dá),同時(shí)也提升了SSCs標(biāo)志物PLZF蛋白的表達(dá);細(xì)胞增殖活性檢測(cè)結(jié)果顯示2i培養(yǎng)條件對(duì)共培養(yǎng)體系中細(xì)胞(含SSCs)的增殖活性有輕度的抑制作用;使用雙氧水誘導(dǎo)SSCs凋亡,發(fā)現(xiàn)添加2i可以有效抵御雙氧水的凋亡刺激,顯示2i培養(yǎng)條件具有抗凋亡的效果。以上結(jié)果說明2i培養(yǎng)條件有利于牛SSCs體外培養(yǎng)過程中干細(xì)胞特性的維持。有研究表明,組蛋白甲基化修飾與小鼠SSCs的多能性細(xì)胞的干細(xì)胞狀態(tài)有密切關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)初步探究了2i培養(yǎng)條件對(duì)牛SSCs組蛋白H3賴氨酸(K9)三甲基化修飾(H3K9me3)的影響。免疫熒光染色結(jié)果顯示,2i培養(yǎng)條件能顯著降低牛SSCs組蛋白H3K9me3修飾水平;熒光定量PCR進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果表明2i培養(yǎng)條件也相應(yīng)降低了Suv39h1/h2的表達(dá)。這提示,2i培養(yǎng)條件可能通過Suv39h1/h2介導(dǎo)牛SSCs的H3K9me3修飾。綜上所述,本研究在冷凍保存牛睪丸組織,以及分離、富集和鑒定SSCs的基礎(chǔ)之上,將2i培養(yǎng)條件用于牛SSCs的的體外培養(yǎng),初步證實(shí)了小分子抑制劑2i在牛SSCs干性維持中的作用,及其對(duì)SSCs組蛋白H3K9me3表觀修飾水平影響。本研究可以為從組蛋白甲基化表觀修飾層面探究牛SSCs的干性維持機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：牛 精原干細(xì)胞 分離 培養(yǎng) 組蛋白 H3K9三甲基化
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S823
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 英文縮寫詞表10-11
• 前言11-13
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述13-24
• 第1章 SSCs研究基礎(chǔ)13-18
• 1.1 SSCs生物學(xué)特征13-14
• 1.2 SSCs分離和富集14-15
• 1.3 SSCs鑒定15-16
• 1.4 SSCs冷凍保存16-17
• 1.5 SSCs移植17-18
• 第2章 影響SSCs體外培養(yǎng)的因素18-21
• 2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基18-19
• 2.2 飼養(yǎng)層19
• 2.3 細(xì)胞因子19-21
• 第3章 干細(xì)胞與組蛋白甲基化修飾21-23
• 3.1 組蛋白甲基化21-22
• 3.2 組蛋白去甲基化22-23
• 第4章 總結(jié)與展望23-24
• 第二篇 研究內(nèi)容24-61
• 第1章 成年牛SSCs的分離富集和冷凍保存24-39
• 1.1 材料與試劑24-27
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法27-31
• 1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果31-36
• 1.4 討論36-37
• 1.5 小結(jié)37-39
• 第2章 2i條件對(duì)牛SSCs體外培養(yǎng)過程中細(xì)胞特性的影響39-56
• 2.1 材料與試劑39-41
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法41-47
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果47-53
• 2.4 討論53-55
• 2.5 小結(jié)55-56
• 第3章 2i培養(yǎng)條件對(duì)牛SSCs組蛋白H3K9me3的影響56-61
• 3.1 材料與試劑56-57
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法57-58
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果58-60
• 3.4 討論60
• 3.5 小結(jié)60-61
• 結(jié)論61-62
• 參考文獻(xiàn)62-74
• 附錄74-76
• 攻讀碩士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文76-77
• 導(dǎo)師簡(jiǎn)介77-78
• 作者簡(jiǎn)介78-79
• 致謝79

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