目前,還未見到有關(guān)鴨疫里黙氏桿菌（RA）表面抗原D15截短蛋白的深入研究報(bào)道。本試驗(yàn)通過對(duì)本實(shí)驗(yàn)室在NCBI GenBank注冊的Riemerella anatipestifer D15基因（登錄號(hào)為CP003787）進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,對(duì)D15基因N端的主要抗原域進(jìn)行了克隆和原核表達(dá)、重組蛋白純化和多克隆抗體制備、檢測鴨疫里黙氏桿菌抗體的重組tD15蛋白乳膠凝集試驗(yàn)的建立、RAD15截短蛋白單克隆抗體的制備及初步鑒定,結(jié)果如下：1.D15基因的生物信息學(xué)分析通過對(duì)D15基因及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)、抗原性、功能位點(diǎn)以及稀有密碼子等進(jìn)行了全面的生物信息學(xué)分析,結(jié)果顯示RA D15基因包含2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域,與多種黃桿菌屬同源蛋白的核酸和氨基酸序列具有較高的同源性。其編碼產(chǎn)物含有信號(hào)肽、1個(gè)跨膜區(qū),可以定位于細(xì)胞外膜,抗原表位較多且在N端相對(duì)較多,不含有多個(gè)連續(xù)的稀有密碼子。2.D15 N端基因的克隆、原核表達(dá)及多克隆抗體制備在上述分析基礎(chǔ)上克隆了該基因并利用原核表達(dá)系統(tǒng)pET-28a（+）,表達(dá)了部分ORF編碼產(chǎn)物（完整ORF編碼產(chǎn)物不表達(dá)）,經(jīng)SDS-PAGE分析表明融合蛋白大小約為34 k... 

【文章來源】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)四川省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：77 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
英文縮寫詞匯及其含義說明
第一部分 引言
    一、Omp85蛋白家族的研究進(jìn)展
        1. Omp85蛋白家族的廣泛性
        2. Omp85蛋白家族的結(jié)構(gòu)與功能
            2.1 Omp85蛋白家族的結(jié)構(gòu)
            2.2 Omp85蛋白家族的功能
                2.2.1 參與其他β筒型蛋白的裝配,整合相關(guān)蛋白質(zhì)至外膜蛋白
                    2.2.1.1 Omp85參與其他β筒形蛋白質(zhì)的組裝機(jī)制-細(xì)菌外膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制
                    2.2.1.2 Omp85參與其他β筒形蛋白質(zhì)的組裝機(jī)制-線粒體外膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制
                    2.2.1.3 Omp85參與其他β筒形蛋白質(zhì)的組裝機(jī)制-葉綠體外膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制
                2.2.2 影響其他β筒形蛋白的成熟與定位,對(duì)細(xì)胞的生長、分化和存活具有重要作用
                2.2.3 Omp85蛋白家族的免疫原性
        3. 展望
    二、選題目的和意義
第二部分 試驗(yàn)研究
    1 材料
        1.1 基因文庫和D15氨基酸參考序列
        1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞株
        1.3 載體與蛋白
        1.4 菌株與血清
        1.5 儀器與器材
        1.6 主要試劑及配制
            1.6.1 常規(guī)分子生物學(xué)用試劑
            1.6.2 分析純化學(xué)試劑
            1.6.3 常用試劑的配制
            1.6.4 細(xì)胞培養(yǎng)試劑
            1.6.5 ELISA試驗(yàn)試劑
    2 方法
        2.1 RA D15基因的生物信息學(xué)分析
            2.1.1 RA D15蛋白質(zhì)的組成及其功能預(yù)測
            2.1.2 RA D15蛋白質(zhì)的抗原性分析
            2.1.3 RA D15核苷酸序列的密碼子偏愛性分析
        2.2 RA表面抗原D15 N端基因克隆、原核表達(dá)及多抗制備
            2.2.1 RA D15截短基因的擴(kuò)增
                2.2.1.1 RA D15截短基因引物的設(shè)計(jì)
                2.2.1.2 RA CH-1株基因組的提取
                2.2.1.3 RA D15截短基因的PCR擴(kuò)增
            2.2.2 PCR產(chǎn)物的T克隆與鑒定
                2.2.2.1 PCR產(chǎn)物的T克隆
                2.2.2.2 DH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備
                2.2.2.3 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞
                2.2.2.4 T克隆鑒定
            2.2.3 構(gòu)建RA tD15基因的原核表達(dá)載體
                2.2.3.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定
                2.2.3.2 目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定
            2.2.4 兔抗RA tD15重組蛋白多克隆抗體的制備與鑒定
                2.2.4.1 兔抗RA tD15重組蛋白多克隆抗體的制備
                2.2.4.2 兔抗RA tD15重組蛋白多克隆抗體效價(jià)的測定
                2.2.4.3 兔抗RA tD15重組蛋白IgG與RA的凝集實(shí)驗(yàn)
            2.2.5 兔抗RA tD15重組蛋白IgG的純化和鑒定
                2.2.5.1 兔抗RA tD15重組蛋白IgG的粗提
                2.2.5.2 陰離子交換層析法純化兔抗重組tD15蛋白IgG
                2.2.5.3 兔抗重組tD15蛋白IgG純度鑒定
        2.3 檢測RA的重組tD15蛋白乳膠凝集試驗(yàn)的建立
            2.3.1 tD15蛋白致敏乳膠試劑的制備
            2.3.2 RA tD15蛋白致敏乳膠最佳條件的篩選
                2.3.2.1 最佳羧化乳膠濃度的選擇
                2.3.2.2 最佳重組蛋白偶聯(lián)濃度的選擇
                2.3.2.3 最佳封閉液濃度的選擇
                2.3.2.4 最佳偶聯(lián)時(shí)間的選擇
                2.3.2.5 最佳的致敏緩沖液pH值的選擇
                2.3.2.6 偶聯(lián)效率的測定
            2.3.3 操作步驟及結(jié)果判定
            2.3.4 致敏乳膠質(zhì)量鑒定
                2.3.4.1 自凝性
                2.3.4.2 特異性
                2.3.4.3 重復(fù)性
                2.3.4.4 敏感性
                2.3.4.5 對(duì)比試驗(yàn)
        2.4 RA表面抗原tD15蛋白單克隆抗體的制備及鑒定
            2.4.1 免疫原的制備
            2.4.2 抗RA tD15單克隆抗體的制備
                2.4.2.1 BALB/c小鼠的免疫
                2.4.2.2 小鼠骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備
                2.4.2.3 細(xì)胞融合及陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選
                2.4.2.4 雜交瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)與傳代.復(fù)蘇與凍存
                2.4.2.5 腹水單抗的制備與純化
            2.4.3 McAb特性鑒定
                2.4.3.1 穩(wěn)定性
                2.4.3.2 單抗亞類測定
                2.4.3.3 特異性
                2.4.3.4 效價(jià)測定
            2.4.4 單抗親和常數(shù)的測定
            2.4.5 單抗抗原表位的初步鑒定
    3 結(jié)果
        3.1 RA D15基因的生物信息學(xué)分析
            3.1.1 RA D15基因序列相似性搜索結(jié)果
            3.1.2 蛋白質(zhì)的組成及其功能預(yù)測
                3.1.2.1 氨基酸理化特性的分析
                3.1.2.2 信號(hào)肽切割位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果
                3.1.2.3 跨膜區(qū)預(yù)測結(jié)果
                3.1.2.4 分析蛋白功能位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果
                3.1.2.5 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果
                3.1.2.6 亞細(xì)胞定位分析結(jié)果
            3.1.3 蛋白質(zhì)的抗原性分析
                3.1.3.1 B細(xì)胞抗原表位預(yù)測
                3.1.3.2 T細(xì)胞抗原表位預(yù)測
            3.1.4 RA D15基因密碼子偏愛性分析
                3.1.4.1 氨基酸組成和密碼子使用頻率偏愛分析
                3.1.4.2 RA D15基因稀有密碼子的分析
                3.1.4.3 RA D15基因的密碼子與大腸桿菌、酵母及人的密碼子偏愛性比較
        3.2 RA表面抗原D15 N端基因克隆、原核表達(dá)及多克隆抗體制備
            3.2.1 RA D15 N端基因的擴(kuò)增及其T克隆鑒定
            3.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-tD15的鑒定
            3.2.3 pET-28a(+)-tD15融合表達(dá)質(zhì)粒的誘導(dǎo)與鑒定
            3.2.4 兔抗RA tD15重組蛋白IgG特性測定
                3.2.4.1 兔抗RA tD15重組蛋白IgG效價(jià)的測定
                3.2.4.2 兔抗RA tD15重組蛋白IgG與IR A的凝集實(shí)驗(yàn)
                3.2.4.3 兔抗RA tD15重組蛋白IgG的純化
        3.3 檢測RA抗體的重組tD15蛋白乳膠凝集試驗(yàn)的建立
            3.3.1 RA tD15蛋白致敏乳膠最佳條件的篩選
                3.3.1.1 最佳羧化乳膠濃度的選擇
                3.3.1.2 最佳重組蛋白偶聯(lián)濃度的選擇
                3.3.1.3 最佳封閉液濃度的選擇
                3.3.1.4 最佳偶聯(lián)時(shí)間的選擇
            3.3.2 致敏乳膠質(zhì)量鑒定
                3.3.2.1 自凝性
                3.3.2.2 特異性
                3.3.2.3 重復(fù)性
                3.3.2.4 敏感性
                3.3.2.5 對(duì)比試驗(yàn)
        3.4 RA表面抗原tD15蛋白單克隆抗體的制備及鑒定
            3.4.1 免疫原的制備
            3.4.2 抗RA tD15 McAb的制備
                3.4.2.1 雜交瘤細(xì)胞株的建立與篩選
                3.4.2.2 腹水單抗的制備與純化
            3.4.3 McAb特性鑒定
                3.4.3.1 穩(wěn)定性
                3.4.3.2 抗體亞類測定
                3.4.3.3 特異性
                3.4.3.4 細(xì)胞培養(yǎng)上清及腹水效價(jià)的測定
            3.4.4 單抗親和常數(shù)的測定
            3.4.5 單抗抗原表位的初步鑒定
    4 討論
        4.1 RA D15基因的生物信息學(xué)分析
        4.2 RA表面抗原D15 N端基因克隆、原核表達(dá)及多克隆抗體制備
        4.3 檢測RA抗體的重組tD15蛋白乳膠凝集試驗(yàn)的建立
        4.4 RA表面抗原tD15蛋白單克隆抗體的制備及鑒定
第三部分 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：3387141