發(fā)布時(shí)間：2021-09-03 04:17

　　多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida, P.multocida）屬于巴氏桿菌科巴氏桿菌屬,是革蘭氏陰性菌,能夠引起動(dòng)物的急性和慢性感染,發(fā)病率和死亡率很高,臨床特征表現(xiàn)為肺炎、萎縮性鼻炎、皮膚壞死、蜂窩組織炎、膿腫、腦膜炎和出血性敗血癥,引起的主要?jiǎng)游锛膊“ㄇ莼魜y、牛出血性敗血癥、兔出血性敗血癥、豬萎縮性鼻炎和豬肺疫。Lon是一種ATP依賴(lài)的蛋白酶,可降解異常蛋白和特異性調(diào)控其它調(diào)控蛋白,與細(xì)菌的致病性有關(guān)。從感染多殺性巴氏桿菌兔肝臟組織篩選鑒定lon基因,驗(yàn)證其酶活性,構(gòu)建其突變株,對(duì)揭示多殺性巴氏桿菌的致病機(jī)制及調(diào)節(jié)機(jī)制有重要意義。本研究利用PCR擴(kuò)增多殺性巴氏桿菌C51-17株lon基因,將其克隆到質(zhì)粒pET30a（+）中, pET30a-Lon轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)0.1mmoI/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá),采用Ni-NTA His-Bind Resin純化Lon蛋白。SDS-PAGE結(jié)果表明,重組Lon蛋白分子量大小97ku,主要以可溶性蛋白形式表達(dá)；western blot檢測(cè)結(jié)果表明,重組蛋白能夠被P.multocida陽(yáng)性血清... 

【文章來(lái)源】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黑龍江省 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：58 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 多殺性巴氏桿菌研究概況
        1.1.1 流行現(xiàn)狀
        1.1.2 傳播途徑
        1.1.3 危害
    1.2 病原學(xué)
        1.2.1 分類(lèi)、生長(zhǎng)特性及理化性質(zhì)
        1.2.2 抗原與血清型
    1.3 主要毒力因子的研究進(jìn)展
        1.3.1 脂多糖
        1.3.2 莢膜
        1.3.3 多殺性巴氏桿菌毒素
        1.3.4 外膜蛋白
        1.3.5 調(diào)控蛋白
    1.4 臨床癥狀
    1.5 診斷方法
        1.5.1 病原學(xué)診斷
        1.5.2 血清學(xué)診斷
        1.5.3 分子生物學(xué)診斷
    1.6 多殺性巴氏桿菌的防治
    1.7 疫苗的研究進(jìn)展
        1.7.1 滅活菌苗
        1.7.2 亞單位疫苗
        1.7.3 弱毒疫苗
    1.8 研究的目的和意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞
        2.1.2 菌株和質(zhì)粒
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 主要儀器
        2.1.5 主要試劑的配制
    2.2 方法
        2.2.1 C51-17菌株基因組的提取
        2.2.2 引物合成與設(shè)計(jì)
        2.2.3 多殺性巴氏桿菌Lon蛋白酶的ATPase活性檢測(cè)
        2.2.4 自殺性質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.5 多殺性巴氏桿菌C51-17電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備
        2.2.6 自殺性質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化
        2.2.7 突變株的篩選及鑒定
        2.2.8 突變株的生物學(xué)特性
        2.2.9 Δlon突變株抗逆性實(shí)驗(yàn)
        2.2.10 突變株的粘附特性實(shí)驗(yàn)
        2.2.11 突變株的致病性試驗(yàn)
3 結(jié)果與分析
    3.1 Lon蛋白酶的ATPase活性檢測(cè)
        3.1.1 重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-Lon的鑒定結(jié)果
        3.1.2 重組蛋白的表達(dá)、純化和western blot檢測(cè)結(jié)果
        3.1.3 ELISA檢測(cè)Lon蛋白多克隆抗體的效價(jià)結(jié)果
        3.1.4 Lon蛋白酶ATPase活性檢測(cè)
    3.2 lon上下游同源臂的PCR擴(kuò)增結(jié)果
    3.3 自殺性質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果
    3.4 自殺性質(zhì)粒PBC-Δlon的電轉(zhuǎn)化及Δlon突變株的篩選結(jié)果
        3.4.1 Δlon突變株的PCR鑒定結(jié)果
        3.4.2 Δlon突變株的生物學(xué)特性測(cè)定結(jié)果
        3.4.3 突變株抗逆特性結(jié)果分析
        3.4.4 Δlon突變株的粘附試驗(yàn)結(jié)果
        3.4.5 Δlon對(duì)小鼠的致病性結(jié)果
4 討論
    4.1 Lon蛋白酶ATPase檢測(cè)
    4.2 細(xì)菌突變株構(gòu)建技術(shù)
    4.3 細(xì)菌的生長(zhǎng)特性及對(duì)細(xì)胞的粘附
5 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[2]兔巴氏桿菌病的綜合防治[J]. 于春雷,王靜.  今日畜牧獸醫(yī). 2008(05)
[3]禽霍亂蜂膠滅活疫苗的制苗及電鏡觀察[J]. 于智慧,沈志強(qiáng).  中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志. 2006(03)
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[6]禽霍亂雙型原生質(zhì)體融合株的篩選及其免疫原性研究[J]. 于鳳剛,胡永浩,汪清,宗瑞謙,沈正達(dá).  中國(guó)獸醫(yī)科技. 1996(09)
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本文編號(hào)：3380388