發(fā)布時間：2021-09-03 05:10

　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?利用B型流感病毒B/Yamagata/16/88 8質(zhì)粒反向遺傳操作系統(tǒng),以B型流感病毒為骨架,分別構(gòu)建含有H5 2.3.4.4譜系H5N6亞型禽流感病毒HA基因的A/B嵌合流感病毒株及A/B嵌合流感病毒減毒株,作為H5亞型流感的疫苗候選株。對拯救的兩種嵌合病毒進(jìn)行鑒定,并初步評價其致病性以及免疫保護(hù)效力,為新型流感疫苗的研發(fā)及B型流感病毒包裝機(jī)制的研究提供了新的思路。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及方法:病毒的拯救與鑒定。對H5 2.3.4.4譜系HA進(jìn)行改造,利用反向遺傳技術(shù)拯救A/B型嵌合流感病毒株和A/B型嵌合流感減毒株,對拯救成功的兩種病毒株進(jìn)行形態(tài)學(xué)和序列鑒定。嵌合毒株BALB/c小鼠的致病性實(shí)驗(yàn)。將嵌合毒株分別以10⁵EID₅₀/50μl,10⁴EID₅₀/50μl等不同劑量,嵌合減毒株分別以10⁴EID₅₀/50μl,10³EID₅₀/50μl,10²EID₅₀/5... 

【文章來源】：軍事科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

HA0前體結(jié)構(gòu)，箭頭指示切割位點(diǎn)；（b）HA0前體裂解為HA1和HA2示意圖；（c）不同流感病毒HA切割位點(diǎn)處氨基酸序列比對[26]

圖 3 A 型流感病毒及其核糖核蛋白復(fù)合體（vRNP）結(jié)構(gòu)示意圖[30] Schematic diagram of influenza A virus and its ribonucleoprotein complex (vRNP)[30為單股負(fù)鏈的 RNA 病毒，流感病毒的復(fù)制需要依賴 RNA 聚合酶。由 vR 聚合酶的作用下首先要轉(zhuǎn)錄出互補(bǔ)的正鏈 RNA 后，以正鏈 RNA 為模板 RNA 以及病毒蛋白，這為從克隆的 cDNA 產(chǎn)生具有傳染性的流感病毒帶。因?yàn)榉戳x的 RNA 病毒的基因組 vRNA 不能作為病毒蛋白質(zhì)合成的直接是病毒 vRNA 需要在被病毒核蛋白（NP）包裹后，通過 RNA 聚合酶復(fù)成 mRNA。因此，流感病毒最小的復(fù)制單元應(yīng)該是由 NP，聚合酶以及病形成的 vRNP[31]。1990 年，Palese 及他的同事[32]開創(chuàng)了依賴輔助病毒的病毒反向遺傳系統(tǒng)，在這個方法中，流感病毒的核糖核蛋白復(fù)合物（R vRNA，純化的聚合酶以及 NP 蛋白一起人工合成產(chǎn)生的，然后用合成染真核細(xì)胞，隨后用輔助病毒感染轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以產(chǎn)生拯救病毒。1994 年nn 等人開發(fā)了可以在轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)合成拯救病毒 vRNA 的 RNA 聚合酶Ⅰ毒的質(zhì)�？寺∪胼d體，兩端連接 RNA 聚合酶Ⅰ的啟動子和終止子，將重染真核細(xì)胞，隨后用輔助病毒感染轉(zhuǎn)染細(xì)胞后獲得拯救病毒。但是這兩

軍事科學(xué)院碩士學(xué)位論文聚合酶Ⅰ啟動子控制，生成病毒 RNA，將拯救病毒 PB2，PB1，PA，NP片段由聚合酶Ⅱ啟動子控制，表達(dá)病毒聚合酶及 NP 蛋白。002 年 Hoffmann 等人以及 David Jackson 等人分別提出了 B 型流感病毒反統(tǒng)的構(gòu)建。David Jackson 等人[34]運(yùn)用反向遺傳系統(tǒng)拯救重組 A 型流感病建立了 B 型流感病毒反向遺傳系統(tǒng)。他們利用 pPRG 作為載體，在 B 型基因片段的 5’末端拼接上人 RNA 聚合酶啟動子Ⅰ，在 3’末端拼接上丁型的核酶終止子。他們還構(gòu)建了表達(dá)流感病毒RNA聚合酶3種蛋白PB2，PBP 的輔助質(zhì)粒，將這些質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞獲得 B 型流感病毒。Hoffma5]將 pHW2000 載體改造為 pAD3000 載體，在將 B 型流感病毒基因片段兩 RNA 聚合酶Ⅰ和 RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄單元，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 COS7 細(xì)胞流感病毒。如圖 4 所示。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]B型流感病毒B/Yamagata/16/88反向遺傳操作平臺的搭建及BALB/c小鼠感染模型的建立[J]. 孫偉洋,于志君,李雪,陳強(qiáng),高曉龍,國嬌,張坤,李元果,王鐵成,楊松濤,黃耕,趙永坤,高玉偉,夏咸柱.  中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)報. 2015(01)
[2]H5N1亞型高致病性禽流感病毒A/goose/Guangdong/1/96株反向基因操作系統(tǒng)的建立[J]. 李澤君,焦培榮,于康震,陳化蘭.  中國農(nóng)業(yè)科學(xué). 2005(08)
[3]流感減毒活疫苗的歷史回顧[J]. 劉啟良.  國外醫(yī)學(xué).預(yù)防.診斷.治療用生物制品分冊. 2002(01)



本文編號：3380475