旨在建立快速特異的牛輪狀病毒（BRV）實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法,用于病原初步篩查。首先以BRV VP4作為目的基因,通過查詢Genbank設(shè)計(jì)合成引物,然后將擴(kuò)增的VP4基因片段克隆至pMD 18-T載體中,構(gòu)建重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,最后經(jīng)優(yōu)化反應(yīng)條件,建立了最低檢測量可達(dá)7.21 copies/μl的EvaGreen熒光定量檢測方法。經(jīng)驗(yàn)證,該方法特異性好,對牛病毒性腹瀉病毒、牛冠狀病毒、豬瘟病毒、豬流行性腹瀉病毒及牛結(jié)核分枝桿菌的檢測結(jié)果均為陰性;重復(fù)性較強(qiáng),組內(nèi)重復(fù)和組間重復(fù)變異系數(shù)分別為0.95%～1.12%和1.55%～2.18%。此外,利用該方法檢測了21份ELISA陽性樣本,測得陽性符合率為90.47 %。本研究建立的BVR VP4 RT-qPCR檢測方法特異、敏感、可重復(fù),可用于病原的快速檢測,為BRV臨床診斷提供了一種高效、可靠的檢測方法。 

【文章來源】：甘肅畜牧獸醫(yī). 2020,50(11)

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

VP4基因擴(kuò)增條帶

對建立的RT-qPCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,最佳反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性15 min;95 ℃變性15 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s,共40個(gè)循環(huán);72 ℃再延伸10 min。以優(yōu)化后的RT-qPCR檢測5個(gè)不同濃度(10-1～103)的重組質(zhì)粒pMD 18-T-VP4,其Ct值分別為29.02、25.35、20.78、17.86和14.73。得出標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖2)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.425,截距為30.86,相關(guān)系數(shù) R2=0.992,Ct值之間呈良好的線性關(guān)系�；貧w方程為Y=-3.425X+30.86;X為陽性質(zhì)粒模板拷貝數(shù)以10為底的對數(shù)值。從而可以得出X與Ct值之間的線性關(guān)系曲線方程式為Ct=30.86-3.425X。不同濃度重組質(zhì)粒的Ct值,從試驗(yàn)結(jié)果中直接讀取,Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可計(jì)算出VP4初始拷貝數(shù)。

BRV RT-q PCR特異性檢測

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