豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）引起的病毒性傳染病。該病以妊娠母豬發(fā)熱、厭食、早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障礙,新生及斷奶前仔豬高死亡率以及各年齡段尤其是仔豬的呼吸道疾病為特征。1987年該病第一次在美國被發(fā)現(xiàn),1991年在荷蘭分離到該病毒,1996年中國成功分離到了第一株P(guān)RRSV CH-1a株。目前該病流行于世界各養(yǎng)豬國家,給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,是威脅當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)最重要的傳染病之一。目前檢測PRRSV抗體的方法有很多,在臨床上主要是用ELISA的方法檢測,其中以N蛋白和GP5蛋白包被居多,在臨床上都有較高的符合率。本研究主要以純化的重組N蛋白和人工合成的兩個N蛋白抗原（P30和P32）表位做包被抗原,建立方法進(jìn)行臨床樣本檢測,并和商品化試劑盒（IDEXX和LSI）進(jìn)行比較。主要研究內(nèi)容如下：1.PRRSVORF7基因的克隆與表達(dá)... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略語表
1. 文獻(xiàn)綜述
    1.1 PRRSV的分子生物學(xué)特征
        1.1.1 PRRSV基因組結(jié)構(gòu)
        1.1.2 PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白的功能
        1.1.3 PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白的功能
    1.2 PRRSV體液免疫和細(xì)胞免疫的研究進(jìn)展
        1.2.1 PRRSV體液免疫研究進(jìn)展
        1.2.2 PRRSV細(xì)胞免疫研究進(jìn)展
    1.3 PRRSV疫苗研究進(jìn)展
        1.3.1 弱毒活疫苗
        1.3.2 滅活疫苗
        1.3.3 基因工程疫苗
    1.4 PRRSV診斷方法的研究進(jìn)展
        1.4.1 臨床癥狀與病理變化
        1.4.2 病毒分離與分子生物學(xué)診斷方法
        1.4.3 血清學(xué)診斷
    1.5 本研究的目的與意義
2. 材料和方法
    2.1 材料
        2.1.1 毒株,菌株,實(shí)驗(yàn)動物和多肽
        2.1.2 載體與試劑
        2.1.3 引物的設(shè)計與合成
        2.1.4 抗體
        2.1.5 血清
        2.1.6 SDS-PAGE和Western blot試劑和溶液
        2.1.7 培養(yǎng)基的配制
        2.1.8 間接ELISA所需試劑的配制
        2.1.9 主要儀器
        2.1.10 其他試劑耗材
    2.2 方法
        2.2.1 PRRSV病毒的培養(yǎng)
        2.2.2 PRRSV的RNA提取
        2.2.3 PRRSV ORF7基因的PCR擴(kuò)增與檢測
        2.2.4 PCR產(chǎn)物的回收和純化
        2.2.5 純化產(chǎn)物和T載體連接
        2.2.6 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α
        2.2.7 重組質(zhì)粒的提取
        2.2.8 ORF7基因片段的序列測定及分析
        2.2.9 原核表達(dá)載體pET32a-ORF7的構(gòu)建
        2.2.10 重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL_(21)(DE3)感受態(tài)
        2.2.11 重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-ORF7在大腸桿菌BE_(21)(DE3)中的誘導(dǎo)表達(dá)
        2.2.12 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析
        2.2.13 表達(dá)產(chǎn)物的純化
        2.2.14 表達(dá)產(chǎn)物的Western blot檢測
        2.2.15 PRRSV N蛋白兩個抗原表位的合成肽的分析與合成
        2.2.16 間接ELISA方法的操作程序
        2.2.17 重組N蛋白,P30,P32間接ELISA方法最佳反應(yīng)條件的確定
3. 結(jié)果與分析
    3.1 ORF7基因PCR擴(kuò)增結(jié)果
    3.2 原核表達(dá)載體pET32a-ORF7鑒定
    3.3 原核表達(dá)載體pET32a-ORF7在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)
    3.4 表達(dá)產(chǎn)物的純化
    3.5 純化蛋白的濃度的測定
    3.6 表達(dá)產(chǎn)物的Western blot鑒定
    3.7 N蛋白抗原表位的合成肽P30和P32的選取
    3.8 間接ELISA方法最佳反應(yīng)條件的確定
        3.8.1 合成肽最佳包被濃度和血清最佳稀釋倍數(shù)的確定
        3.8.2 最佳二抗稀釋倍數(shù)的確定
        3.8.3 判定標(biāo)準(zhǔn)的確定
        3.8.4 特異性試驗(yàn)結(jié)果
        3.8.5 敏感性試驗(yàn)
        3.8.6 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果
        3.8.7 臨床樣品檢測
4. 討論
    4.1 PRRSV ORF7基因的選擇
    4.2 N蛋白兩個抗原表位的選擇
    4.3 關(guān)于間接ELISA方法的建立
    4.4 建立的ELISA方法和商品化試劑盒的比較
5. 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：3356251