發(fā)布時(shí)間：2017-04-29 20:10

  本文關(guān)鍵詞：基于牛布魯菌外膜蛋白OMP19、OMP22和OMP28三種重組蛋白的ELISA檢測(cè)方法研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：布魯菌病(Brucellosis)作為一種在世界范圍內(nèi)危害嚴(yán)重的人畜共患病,具有重要的獸醫(yī)公共衛(wèi)生意義。為建立一種牛布魯菌病快速可靠的血清學(xué)檢測(cè)方法,本論文在對(duì)其三種外膜蛋白原核表達(dá)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了基于重組蛋白混合抗原的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)研究,具體如下：根據(jù)GenBank中登錄的編碼牛布魯菌外膜蛋白OMP19、OMP22、OMP28的基因序列,以布魯菌A544株基因?yàn)槟０?分別設(shè)計(jì)了3對(duì)特異性引物,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因片段。將目的基因分別克隆到pCold-TF原核表達(dá)載體系統(tǒng)中,經(jīng)PCR鑒定、酶切鑒定和測(cè)序鑒定正確后進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)、重組蛋白的SDS-PAGE分析與Western blot鑒定,并利用親和層析技術(shù)對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化,結(jié)果成功擴(kuò)增出534 bp、639 bp和753bp的編碼牛布魯菌外膜蛋白OMP19、OMP22、 OMP28的基因序列,并克隆到pCold-TF原核表達(dá)載體構(gòu)建了3種蛋白基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pCold-TF-OMP19、pCold-TF-OMP22和pCold-TF-OMP28。誘導(dǎo)表達(dá)的3種重組蛋白分別為69kD、74 kD和80 kD,均為可溶性蛋白,Western blot顯示均有良好反應(yīng)原性。利用親和層析技術(shù)對(duì)三種重組蛋白進(jìn)行純化,獲得了高純度的蛋白。將三種重組蛋白按濃度比,等比例混合作為包被抗原,經(jīng)過(guò)優(yōu)化包被條件、封閉條件、反應(yīng)溫度和時(shí)間等初步建立了牛布魯菌感染抗體檢測(cè)的間接酶聯(lián)免疫吸附方法(indirect ELISA, iELISA),并進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室保存的300份臨床樣品檢測(cè)應(yīng)用,同時(shí)進(jìn)行虎紅平板凝集實(shí)驗(yàn)(RBPT),同類進(jìn)口商品化試劑(IDEXX)的平行檢測(cè)。結(jié)果顯示建立的iELISA方法,最佳的混合抗原濃度為(1:1:1)μg/ml,最適封閉液為10%馬血清,最適一抗稀釋度為1：200,二抗稀釋度為1：20000。該方法特異性良好,不與小腸結(jié)腸炎耶爾森菌診斷血清和大腸桿菌診斷血清發(fā)生交叉反應(yīng)。300份臨床血清樣品檢測(cè)結(jié)果顯示虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT)檢測(cè)62份為陽(yáng)性,238份為陰性;以RBPT檢測(cè)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn),IDEXX試劑盒檢測(cè)62份陽(yáng)性血清中60份為陽(yáng)性(假陰性2份),敏感率為96.78%(60/62)： 238份陰性血清中236份為陰性(假陽(yáng)性2份),特異率為99.16%(236/238),總符合率為98.67%(296/300)�；旌峡乖璻OMPs-ELISA法檢測(cè)結(jié)果為,62份陽(yáng)性血清中58份為陽(yáng)性(假陰性4份),敏感率為93.5%(58/62);238份陰性血清中230份為陰性(假陽(yáng)性8份),特異率為96.64%(230/238),總符合率為96%(288/300),為下一步布魯菌抗體檢測(cè)間接ELISA方法的商品化和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：牛布魯菌 重組外膜蛋白 混合抗原 間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.61
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-13
• 文獻(xiàn)綜述13-21
• 第一章 布魯菌病及其檢測(cè)技術(shù)13-21
• 1.1 布魯菌病病原學(xué)13-14
• 1.2 布魯菌病流行病學(xué)14-15
• 1.3 布魯菌病檢測(cè)方法研究進(jìn)展15-18
• 1.3.1 病原學(xué)檢測(cè)方法15-16
• 1.3.2 血清學(xué)檢測(cè)方法16-17
• 1.3.2.1 全乳環(huán)狀實(shí)驗(yàn)(MRT)16
• 1.3.2.2 試管凝集實(shí)驗(yàn)(SAT)16
• 1.3.2.3 虎紅平板凝集實(shí)驗(yàn)(RBPT)16
• 1.3.2.4 補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)(CFT)16
• 1.3.2.5 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)16-17
• 1.3.2.6 熒光偏振試驗(yàn)(FPA)17
• 1.3.2.7 膠體金免疫層析法(GICA)17
• 1.3.3 分子生物學(xué)檢測(cè)方法17-18
• 1.3.3.1 PCR檢測(cè)法17-18
• 1.3.3.2 熒光定量PCR檢測(cè)法18
• 1.3.3.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)18
• 1.4 布魯菌外膜蛋白OMP19、OMP22、OMP28研究進(jìn)展18-19
• 1.5 本研究目的意義19-21
• 試驗(yàn)研究21-51
• 第二章 布魯菌外膜蛋白OMP19、OMP22、OMP28的原核表達(dá)21-37
• 2.1 材料21-23
• 2.1.1 菌種和載體21
• 2.1.2 主要試劑及相關(guān)溶液21-22
• 2.1.3 主要使用儀器22-23
• 2.2 方法23-31
• 2.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成23
• 2.2.2 OMP19、OMP22、OMP28基因的擴(kuò)增23-24
• 2.2.3 目的基因片段的回收24
• 2.2.4 原核表達(dá)載體pCold-TF的抽提24-25
• 2.2.5 原核載體與目的基因的雙酶切25-26
• 2.2.6 原核表達(dá)載體與目的基因的連接與克隆26-27
• 2.2.7 重組質(zhì)粒的陽(yáng)性鑒定27-28
• 2.2.7.1 重組質(zhì)粒的PCR鑒定27
• 2.2.7.2 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定27-28
• 2.2.8 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)28
• 2.2.9 重組蛋白的SDS-PAGE分析28-29
• 2.2.10 重組表達(dá)蛋白的反應(yīng)原性分析29
• 2.2.11 OMP19、OMP22、OMP28重組蛋白的純化29-30
• 2.2.12 測(cè)定純化蛋白的濃度30-31
• 2.3 結(jié)果與分析31-35
• 2.3.1 OMP19、OMP22、OMP28重組表達(dá)載體的構(gòu)建31-32
• 2.3.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果32-33
• 2.3.3 重組質(zhì)粒的序列測(cè)定33
• 2.3.4 重組蛋白的SDS-PAGE及Western blot分析33-35
• 2.4 討論35-37
• 第三章 基于布魯菌OMP19、OMP22和OMP28三種重組蛋白的iELISA方法研究37-51
• 3.1 材料37
• 3.1.1 血清、二抗37
• 3.1.2 主要試劑及相關(guān)溶液37
• 3.2 方法37-40
• 3.2.1 選擇最適的混合抗原包被濃度和酶標(biāo)二抗稀釋度37-38
• 3.2.2 選擇最適的一抗稀釋度38
• 3.2.3 選擇最適的包被條件38
• 3.2.4 選擇最適的封閉液38
• 3.2.5 選擇封閉時(shí)間38
• 3.2.6 選擇最適的一抗反應(yīng)時(shí)間38
• 3.2.7 選擇酶標(biāo)最適的二抗反應(yīng)時(shí)間38-39
• 3.2.8 選擇最適的顯色液和顯色時(shí)間39
• 3.2.9 選擇最適的終止條件39
• 3.2.10 確定臨界值(cut off value)39
• 3.2.11 特異性試驗(yàn)39
• 3.2.12 靈敏度試驗(yàn)39
• 3.2.13 重復(fù)性試驗(yàn)39
• 3.2.14 樣品檢測(cè)與評(píng)價(jià)39-40
• 3.2.14.1 iELISA檢測(cè)40
• 3.2.14.2 RBPT檢測(cè)40
• 3.2.14.3 IDEXX試劑盒檢測(cè)40
• 3.2.14.4 數(shù)據(jù)比較40
• 3.3 結(jié)果與分析40-48
• 3.3.1 最適抗原包被濃度和酶標(biāo)二抗最適稀釋度的確定40-41
• 3.3.2 最適一抗稀釋度的選擇結(jié)果41
• 3.3.3 最適包被條件的選擇結(jié)果41-42
• 3.3.4 最適封閉液的選擇結(jié)果42-43
• 3.3.5 最適封閉時(shí)間的選擇結(jié)果43
• 3.3.6 最適一抗反應(yīng)時(shí)間的選擇結(jié)果43-44
• 3.3.7 最適酶標(biāo)二抗反應(yīng)時(shí)間的選擇結(jié)果44
• 3.3.8 最適顯色液和顯色時(shí)間的選擇結(jié)果44-45
• 3.3.9 最適終止條件的選擇結(jié)果45-46
• 3.3.10 確定臨界值(cut off value)46
• 3.3.11 特異性試驗(yàn)結(jié)果46
• 3.3.12 靈敏性試驗(yàn)結(jié)果46-47
• 3.3.13 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果47
• 3.3.14 評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果47-48
• 3.4 討論48-51
• 結(jié)論部分51-52
• 第四章 試驗(yàn)結(jié)論51-52
• 參考文獻(xiàn)52-57
• 致謝57

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本文編號(hào)：335524