本文關(guān)鍵詞：豬薩佩羅病毒real-time RT-PCR檢測(cè)方法的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：豬薩佩羅病毒感染(porcine sapelovirus infection)是由豬薩佩羅病毒所引起的,臨床表現(xiàn)為豬腦脊髓灰質(zhì)炎、肺炎、繁殖障礙、腹瀉等多系統(tǒng)綜合征及無(wú)明顯癥狀的一種危害養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病。本研究建立了一種檢測(cè)PSV的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法,利用該方法對(duì)PSV感染組織特異性進(jìn)行初步研究,并對(duì)四川省部分地區(qū)PSV感染情況進(jìn)行調(diào)查。在此基礎(chǔ)上,通過(guò)克隆分析1B基因,對(duì)PSV遺傳變異進(jìn)行分析,為進(jìn)一步開(kāi)展相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。本研究根據(jù)GenBank中PSV的3D基因的保守序列設(shè)計(jì)并合成一對(duì)針對(duì)PSV的特異性引物,經(jīng)反應(yīng)條件的優(yōu)化,建立了基于SYBR Green Ⅱ檢測(cè)PSV的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法。熒光定量RT-PCR反應(yīng)所獲的標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示,反應(yīng)中模板DNA的量與熒光定量RT-PCR的CT值呈良好的線性關(guān)系,直線方程為y=-3.307 x+38.706,相關(guān)系數(shù)R2達(dá)到0.999。所建方法特異性強(qiáng),能很好地將PSV與豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬嵴病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒以及A群豬輪狀病毒區(qū)分開(kāi),擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線分析只有1個(gè)單特異峰；敏感性高,檢測(cè)下限為1.44×102copies/μL,比普通PCR敏感100倍；重復(fù)性較好,組內(nèi)變異系數(shù)和組間變異系數(shù)均小于1.5%。應(yīng)用該方法對(duì)8頭自然感染PSV豬的各組織樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),PSV在豬體內(nèi)分布廣泛,而不同組織病毒載量差異較大,最高的為腸道和糞便。對(duì)采集自四川部分地區(qū)規(guī)�；i場(chǎng)2014-2015年間428份臨床腹瀉病料進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,各地區(qū)均存在PSV感染,PSV總陽(yáng)性率為26.6%(114/428),對(duì)各年齡段豬PSV感染率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),5-9周齡豬感染率最高,達(dá)到37.4%(55/147)。以上結(jié)果表明,本研究建立的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法特異性較強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好,可用于該病毒的臨床檢測(cè)、定量分析及流行病學(xué)調(diào)查。為了解PSV的感染情況及毒株的變異情況,本研究設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增豬薩佩羅病毒1B全基因的特異性引物,利用RT-PCR擴(kuò)增不同地區(qū)豬薩佩羅病毒1B全基因,通過(guò)分子克隆,測(cè)序得到14個(gè)豬薩佩羅病毒1B基因序列,核苷酸序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列相似性分別為90.6-100%和97.1-100%。遺傳進(jìn)化分析顯示,本研究獲得的四川株與已知中國(guó)株分屬于一個(gè)大的分支,說(shuō)明我國(guó)豬薩佩羅病毒1B基因序列較為保守,沒(méi)有發(fā)生大的基因變異。所有中國(guó)分離株與韓國(guó)株、德國(guó)株、英國(guó)株處在不同分支,推測(cè)認(rèn)為我國(guó)PSV的流行毒株可能為固有毒株而非引入的新疫情。
【關(guān)鍵詞】：豬薩佩羅病毒 熒光定量RT-PCR 1B基因 遺傳進(jìn)化分析
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S852.651
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 常用縮略詞表8-12
• 文獻(xiàn)綜述12-21
• 1 病原學(xué)12-17
• 1.1 豬薩佩羅病毒的分類(lèi)12-13
• 1.2 豬薩佩羅病毒粒子的結(jié)構(gòu)特征13
• 1.3 豬薩佩羅病毒的基因組結(jié)構(gòu)特征及復(fù)制13-14
• 1.4 病毒的理化特性和培養(yǎng)特性14-15
• 1.5 豬薩佩羅病毒的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白及其功能15-17
• 2 PSV感染的臨診癥狀及病理變化17-18
• 2.1 臨診癥狀17
• 2.2 病理變化17-18
• 3 PSV流行病學(xué)18-19
• 4 豬薩佩羅病毒的檢測(cè)19-21
• 4.1 病毒的分離與鑒定19-20
• 4.2 分子生物學(xué)方法20
• 4.3 免疫學(xué)方法20-21
• 5 防制21
• 研究的目的和意義21-23
• 第一章 豬薩佩羅病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用23-45
• 1 試驗(yàn)材料23-25
• 1.1 毒株23-24
• 1.2 臨床樣品的收集24
• 1.3 主要試劑與儀器24
• 1.4 溶液配制24-25
• 2 試驗(yàn)方法25-33
• 2.1 熒光定量RT-PCR引物的設(shè)計(jì)及合成25
• 2.2 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備25-31
• 2.3 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立31-32
• 2.4 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的應(yīng)用32-33
• 3 結(jié)果33-41
• 3.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的鑒定33
• 3.2 重組質(zhì)粒濃度的測(cè)定33-34
• 3.3 優(yōu)化的Real-time RT-PCR檢測(cè)條件34
• 3.4 Real-time RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作34
• 3.5 溶解曲線與特異性試驗(yàn)結(jié)果34-35
• 3.6 敏感性試驗(yàn)結(jié)果35-36
• 3.7 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果36-37
• 3.8 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR與常規(guī)PCR比較結(jié)果37-39
• 3.9 PSV感染組織特異性研究結(jié)果39
• 3.10 PSV感染情況調(diào)查39-41
• 4 討論41-44
• 4.1 PSV Real-time RT-PCR檢測(cè)方法的建立41-42
• 4.2 PSV感染組織特異性的初步研究42-43
• 4.3 腹瀉豬群中PSV感染情況調(diào)查43-44
• 5 小結(jié)44-45
• 第二章 四川省2014-2015年P(guān)SV 1B基因遺傳進(jìn)化分析45-56
• 1 試驗(yàn)材料45-46
• 1.1 PSV陽(yáng)性樣品45
• 1.2 主要試劑及儀器45-46
• 1.3 分析軟件46
• 2 試驗(yàn)方法46-48
• 2.1 引物設(shè)計(jì)46
• 2.3 1B基因的擴(kuò)增,克隆及測(cè)序46-47
• 2.4 遺傳進(jìn)化分析47-48
• 3 結(jié)果48-53
• 3.3 PSV 1B全基因擴(kuò)增48-49
• 3.4 豬薩羅病毒1B基因測(cè)序結(jié)果49
• 3.5 1B基因核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸同源性分析49-50
• 3.6 1B基因遺傳進(jìn)化樹(shù)的建立50-51
• 3.7 基因突變位點(diǎn)分析51-53
• 4 討論53-55
• 5 小結(jié)55-56
• 全文結(jié)論56-57
• 參考文獻(xiàn)57-63
• 致謝63

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本文編號(hào)：338238