我國是一個養(yǎng)豬大國,同時也具有豐富的地方特色豬品種。但是許多優(yōu)秀地方特色豬種并沒有充分得到利用,其開發(fā)利用和發(fā)掘的潛力是非常巨大的,廣西巴馬小型豬作為我國特有的一種小型豬品系,其遺傳及表型特征穩(wěn)定,同時在生理和解剖學等方面與人類相似,已被用于外科訓練、藥物評價及人類異種皮膚移植試驗。開展廣西巴馬小型豬轉(zhuǎn)基因克隆研究僅有效保存地方豬的優(yōu)秀遺傳特性,而且還為人類生物和醫(yī)學領(lǐng)域提供理想的動物模型,有助于提升地方豬的應(yīng)用范圍和價值。因此以廣西巴馬小型豬為研究對象是一種理想生物和醫(yī)學模型。本研究采用胰蛋白酶法制備新生廣西巴馬小型豬腎臟成纖維細胞,建立巴馬小型豬腎臟成纖維細胞體系。以PEGFP-N1質(zhì)粒用于電轉(zhuǎn)染成纖維細胞并優(yōu)化電轉(zhuǎn)染參數(shù),在優(yōu)化的電轉(zhuǎn)染參數(shù)下轉(zhuǎn)染成纖維細胞并成功篩選出陽性成纖維細胞。以篩選出的轉(zhuǎn)基因成纖維細胞為供體細胞,成功構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因克隆胚胎。通過胚胎移植來進一步在體內(nèi)驗證轉(zhuǎn)基因克隆胚胎的生育能力,并嘗試為構(gòu)建存活的轉(zhuǎn)基因克隆豬提供了支持。為構(gòu)建轉(zhuǎn)基因克隆胚胎,我們開展了如下試驗：實驗一、以巴馬小型豬新生豬仔為材料,采用胰蛋白酶消化法來建立巴巴小型豬腎臟成纖維細胞體系。并成功獲... 

【文章來源】：廣西大學廣西壯族自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數(shù)】：64 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

新生廣西巴馬小型豬腎臟成纖維細胞系的建立A、消化后的細胞；B、培養(yǎng)2h后貼壁細胞；C、原代細胞長至匯合；D、傳代一次的成纖維細胞；E、解凍2h的成纖維細胞；F、解凍細胞培養(yǎng)2d

本試驗對電壓造成細胞電轉(zhuǎn)染效率影響進行了研究。研究發(fā)現(xiàn)不同電壓對細胞的轉(zhuǎn)染效率是不同的，轉(zhuǎn)染后的細胞在培養(yǎng)24小時后進行轉(zhuǎn)染率檢測，如圖2-2B所示：隨著電壓增大，表達綠色突光的細胞比例逐漸升高，當電壓為140V時轉(zhuǎn)染率最高達到16.5±2.2%,雖然其在數(shù)值上高于]20v( 15.0±2.1 %)和160v( 16.3±2.1 %)組，但差異不顯著（p>0.05)。80v(9.7±2.3%)和100v(12.2±2.6%)組之間差異不顯著(p>0.05),兩組均顯著低于120v、140v和160v組(p<0.05)。表明在一定程度上加大電壓量可以提高細胞轉(zhuǎn)率效率，但過高也對轉(zhuǎn)染不利。通過對細胞存活率和細胞電轉(zhuǎn)染效率進行綜合考慮比較發(fā)現(xiàn)：120V組在保存50%左右細胞存活的同時可以獲得相對較高的轉(zhuǎn)染率，因此是本實驗室條件下的最佳電壓，隨后采用該電壓用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因體細胞。33

但均無顯著差異（p>0.05)。GFP-NT克隆胚胎在各個體外發(fā)育時期均高效表達GFP(圖2-5C，D)，表明轉(zhuǎn)基因己穩(wěn)定整合到體細胞基因組并能高效表達。轉(zhuǎn)基因供體細胞具有完全重編程發(fā)育能力，因此，本實驗室構(gòu)建的新生廣西巴馬小型豬腎臟成纖維細胞經(jīng)優(yōu)化的電轉(zhuǎn)染體系進行轉(zhuǎn)基因操作后，具有完全的核重編程能力，從而為進一步構(gòu)建轉(zhuǎn)基因克隆豬奠定了基礎(chǔ)。BH圖2-5各個發(fā)育時期的轉(zhuǎn)GFP克隆胚胎A、_SCNT操作；B、核移植重構(gòu)胚C、2-4-細胞期克隆胚胎；D、囊胚期克隆胚胎。(標尺=100|im)Fig.2-6 GFP transgenic cloned embryos at each development periods in vitro.A. Operation of SCNT; B. Reconstructed embryos after SCNT; C. Cloned 2-4-cell embryos; D.Cloned blastocysts. (Scale bar=100|im)表2 C-NT和GFP-NT克隆胚胎的體外發(fā)育Table2 The development of C-NT and GFP-NT cloned embryos in vitro胚胎類型 培養(yǎng)數(shù) 分裂數(shù)（率?

【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
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本文編號：3354106