為了構(gòu)建具有天然構(gòu)象的小反芻獸疫病毒Nigeria 75/1株病毒樣顆粒,本試驗擴增了Nigeria 75/1株M、F和H基因,并分別克隆至雙啟動子載體pFastBac^TM Dual中,構(gòu)建含有雙目的基因的重組供體質(zhì)粒pFastBac^TM Dual-2M、pFastBac^TM Dual-2F和pFastBac^TM Dual-2H;測序正確后轉(zhuǎn)化至DH10Bac^TM 感受態(tài)細(xì)胞,同源重組獲得穿梭質(zhì)粒rBacmid-2M、rBacmid-2F和rBacmid-2H;將其分別轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9獲得重組桿狀病毒rpFB-2M、rpFB-2F和rpFB-2H。以鼠抗M、H蛋白的主要抗原表位區(qū)多克隆抗體與綿羊抗PPRV陽性血清對重組桿狀病毒感染細(xì)胞進行間接免疫熒光（IFA）鑒定,可見特異性熒光;以3種重組桿狀病毒共感染昆蟲細(xì)胞Sf9的方式組裝病毒樣顆粒,放大培養(yǎng)后進行病毒樣顆粒純化。Western blot檢測純化后樣品可見相對分子質(zhì)量為38 000,59 000,68 000左右的條帶,... 

【文章來源】：中國獸醫(yī)學(xué)報. 2017,37(07)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

圖２重組桿狀病毒的拯救結(jié)果Ａ．發(fā)生病變的Ｓｆ９細(xì)胞；Ｂ．正常的Ｓｆ９細(xì)胞

顯，表現(xiàn)為細(xì)胞出現(xiàn)膨大、脫壁懸涪聚集現(xiàn)象（圖２Ａ），病變細(xì)胞形態(tài)明顯區(qū)別于正常細(xì)胞（圖２Ｂ）。圖２重組桿狀病毒的拯救結(jié)果Ａ．發(fā)生病變的Ｓｆ９細(xì)胞；Ｂ．正常的Ｓｆ９細(xì)胞２．３重組桿狀病毒滴度測定將第３代病毒種ｒｐＦＢ－２Ｍ、ｒｐＦＢ－２Ｆ、ｒｐＦＢ－２Ｈ用ＢａｃＰＡＫＴＭＢａｃｕ－ｌｏｖｉｒｕｓＲａｐｉｄＴｉｔｅｒＫｉｔ試劑盒進行滴定，鏡下可見散在的染色斑點，結(jié)果顯示ｒｐＦＢ－２Ｍ滴度為４．０×１０７ＰＦＵ／ｍＬ（圖３）。應(yīng)用同樣的方法測得ｒｐＦＢ－２Ｆ、ｒｐＦＢ－２Ｈ滴度為３．７×１０７ＰＦＵ／ｍＬ和５．４×１０７ＰＦＵ／ｍＬ。圖３重組桿狀病毒滴定結(jié)果Ａ．１０４稀釋度重組桿狀病毒ｒｐＦＢ－２Ｍ滴定結(jié)果；Ｂ．１０４稀釋度重組桿狀病毒ｒｐＦＢ－２Ｆ滴定結(jié)果；Ｃ．１０４稀釋度重組桿狀病毒ｒｐＦＢ－２Ｈ滴定結(jié)果；Ｄ．正常的Ｓｆ９細(xì)胞２．４重組桿狀病毒的間接免疫熒光檢測（ＩＦＡ）將重組桿狀病毒ｒｐＦＢ－２Ｍ、ｒｐＦＢ－２Ｆ、ｒｐＦＢ－２Ｈ及野生型桿狀病毒分別接種昆蟲Ｓｆ９細(xì)胞４８ｈ后，進行間接免疫熒光染色，結(jié)果顯示重組桿狀病毒表達的ＰＰＲＶＭ、Ｆ、Ｈ蛋白均可被相應(yīng)的鼠抗Ｍ、Ｆ和Ｈ多克隆抗體特異性識別。熒光顯微鏡下可見綠色熒光，而感染野生桿狀病毒的昆蟲細(xì)胞與未感染桿狀病毒的正常昆蟲細(xì)胞則無特異性熒光反應(yīng)，僅呈現(xiàn)紅色細(xì)胞背景（圖４），表明重組桿狀病毒構(gòu)建成功。圖４間接免疫熒光檢測重組蛋白表達結(jié)果Ａ．重組桿狀病毒ｒｐＦＢ－２Ｍ感染的

圖５病毒樣顆粒的構(gòu)建與純化Ａ．蔗糖密度梯度；Ｂ．ＰＰＲＶ病毒樣顆粒；Ｃ．ＰＰＲＶ圖６ＳＤＳ－ＰＡＧＥ與Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ檢測重組蛋白表達結(jié)果Ｍ．蛋白分子相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；Ａ１、Ｂ１、Ｃ１．野生桿狀病毒感染的Ｓｆ９細(xì)胞；Ａ２、Ｂ２、Ｃ２．重組桿狀毒ｒｐＦＢ－２Ｍ／ｒｐＦＢ－２Ｆ／ｒｐＦＢ－２Ｈ感染的Ｓｆ９細(xì)胞２．７小鼠免疫以純化的ＰＰＲＶ病毒樣顆粒（ＶＬＰｓ）免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，小鼠血清ＰＰＲＶ中和抗體檢測結(jié)果表明，ＰＢＳ對照組在整個試驗過程中沒有檢測到中和抗體，病毒樣顆粒免疫組首次免疫２周后，可以在部分小鼠體內(nèi)檢測到抗ＰＰＲＶ中和抗體，抗體陽性率為５０％；在第２周加強免疫后，中和抗體開始上升，小鼠血清陽性率提高到８０％；在第２次免疫２周后繼續(xù)加強免疫，血清陽性率上升至９０％（表１）。表１血清中和抗體效價檢測組別免疫前首免后２周二免疫后２周三免疫后２周ＰＰＲＶ－ＶＬＰｓ＜１∶４（０／１０）１∶４～１∶１６（５／１０）１∶４～１∶３２（８／１０）１∶１６～１∶６４（９／１０）ＰＢＳ＜１∶４（０／１０）＜１∶４～１∶８（０／１０）＜１∶４～１∶８（０／１０）＜１∶４～１∶８（０／１０）注：“（）”內(nèi)數(shù)字的含義：前邊數(shù)字代表ＰＰＲＶ中和抗體陽性的小鼠數(shù)目，后面數(shù)字代表各組小鼠數(shù)量３討論目前，小反芻獸疫主要依賴疫苗免疫預(yù)防，采用感染山羊的病理組織制備的小反芻獸疫滅活疫苗，一般采用甲醛或氯仿滅活，用甲醛滅活的疫苗免疫

【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
[1]小反芻獸疫病毒樣顆粒的構(gòu)建及對小鼠免疫效力的評價[D]. 劉拂曉.吉林大學(xué) 2013

碩士論文
[1]桿狀病毒攜帶的基因拷貝數(shù)與重組蛋白表達效率關(guān)系研究[D]. 楚素霞.河南師范大學(xué) 2011



本文編號：3345486