牛皰疹病毒5型（Bovine herpesvirus5, BoHV-5）屬于α皰疹病毒亞科,具有嗜神經(jīng)性和潛伏感染的特征。BoHV-5能進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）,引起犢牛的致死性腦膜腦炎,給養(yǎng)牛業(yè)造成很大的損失。本實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)報(bào)道在BoHV-5中存在11個(gè)IniRNA的編碼基因,能夠編碼16條成熟的miRNA.這些niRNA能夠在上皮細(xì)胞中大量表達(dá),其中miR-10是表達(dá)量最大的,該IniRNA的前體pre-miR-10的5p端和3p端都能產(chǎn)生一個(gè)成熟的miRNA,但其生物學(xué)功能還不是很清楚.本實(shí)驗(yàn)通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)找出了可能受到miR-10調(diào)控的靶基因,然后通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)篩選出能夠與miR-10相互作用的靶基因。然后再在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平進(jìn)一步驗(yàn)證（?）iR-10-5p對(duì)其靶基因的調(diào)控作用。主要工作包括：1.miR-10靶基因的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證首先經(jīng)過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件（miRanda）分析,得到多個(gè)潛在受到miR-10調(diào)控的靶基因,經(jīng)分析比較挑出UL23、BICP22、UL28、UL37、UL39和Us3。繼而用PCR克隆上上述基因的3’UTR,連接到報(bào)告質(zhì)粒psiCHECK-2... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：53 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表
第1章 文獻(xiàn)綜述
    引言
    1.1 BoHV5流行病學(xué)及其致病性
    1.2 BoHV-5的分子生物學(xué)特征
    1.3 miRNA的生物合成及作用機(jī)制
    1.4 病毒的miRNA
        1.4.1 皰疹病毒與miRNA
    1.5 BoHV-1和BoHV-5編碼的miRNA
    1.6 本研究的目的和意義
第2章 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 病毒、菌種、質(zhì)粒與細(xì)胞
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及耗材
        2.1.3 酶及主要事試劑
        2.1.4 主要溶液及培養(yǎng)基的配制
        2.1.5 本研究中所用的寡核苷酸
        2.1.6 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.2 雙熒光報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)
        2.2.3 Real-time檢測(cè)在RNA水平的調(diào)節(jié)
        2.2.4 Us3多抗的制備
        2.2.5 對(duì)Us3蛋白表達(dá)情況的檢測(cè)
        2.2.6 一步法生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
        2.2.7 凋亡蛋白的檢測(cè)
        2.2.8 流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
        2.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
第3章 結(jié)果和分析
    3.1 BoHV-5 miR-10靶基因的預(yù)測(cè)
    3.2 BoHV5 miR-10與靶基因相互作用的驗(yàn)證
        3.2.1 靶基因3UTR區(qū)的克隆
        3.2.2 雙熒光素報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.2.3 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證miR-10對(duì)預(yù)測(cè)靶基因的調(diào)控
        3.2.4 miR-10-5p種子序列突變后對(duì)靶基因的調(diào)控
        3.2.5. miR-10-5p對(duì)靶基因的調(diào)控的劑量依賴
    3.3 miR-10-5p對(duì)靶基因Us3的調(diào)控在轉(zhuǎn)錄水平上的影響
    3.4 miR-10-5p對(duì)靶基因Us3的調(diào)控在翻譯水平上的影響
        3.4.1 BoHV-5 Us3的原核表達(dá)
        3.4.2. 對(duì)融合蛋白的鑒定
        3.4.3 對(duì)Us3蛋白表達(dá)情況的檢測(cè)
    3.5 過量表達(dá)miR-10-5p對(duì)病毒在上皮細(xì)胞中增殖的影響
    3.6 過量表達(dá)miR-10-5p后病毒對(duì)上皮細(xì)胞凋亡的影響
        3.6.1 對(duì)凋亡蛋白檢測(cè)
        3.6.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)上皮細(xì)胞凋亡
    3.7 過量表達(dá)miR-10-5p對(duì)病毒誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響
        3.7.1 對(duì)凋亡蛋白檢測(cè)
        3.7.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡
第4章 討論與結(jié)論
    4.1 BoHV5 mi-10潛在靶基因的預(yù)測(cè)及篩選
    4.2 miR-10對(duì)預(yù)測(cè)靶基因調(diào)控驗(yàn)證及對(duì)靶基因Us3的調(diào)控
    4.3 過量表達(dá)miR-10-5p對(duì)病毒在上皮細(xì)胞增殖的影響
    4.4 過量表達(dá)miR-10-5p后病毒對(duì)上皮細(xì)胞凋亡的影響
    4.5 過量表達(dá)miR-10-5p病毒對(duì)上皮細(xì)胞凋亡的影響神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響
    4.6 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號(hào)：3341899