發(fā)布時間：2021-08-14 06:03

　　雞毒支原體（Mycoplasma Gallisepticum,MG）屬于支原體目、支原體科、支原體屬,是禽類重要病原體之一。雞毒支原體可感染雞、鴨、鵝、鴿、鵪鶉、火雞、家雀等多種禽類,主要表現(xiàn)為呼吸道癥狀。雞群感染雞毒支原體后除表現(xiàn)咳嗽、流鼻涕、流淚、噦音、呼吸困難等癥狀外,還可導(dǎo)致蛋雞產(chǎn)蛋率下降,種蛋孵化率降低,肉雞生長發(fā)育受阻,飼料轉(zhuǎn)化率降低。該病發(fā)病率極高,幾乎100%的雞場都有此病,雞場一旦感染就很難徹底清除,給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的損失。并且,雞毒支原體的感染可使雞群對其它病原微生物如大腸桿菌、禽流感病毒、新城疫病毒和傳染性支氣管炎病毒等的易感性增加,導(dǎo)致混合或繼發(fā)感染,引起更為嚴(yán)重的呼吸道綜合征,從而使損失加劇。丙酮酸脫氫酶（pyruvate dehydrogenase）是丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的其中的一個酶,是關(guān)鍵的限速酶。已經(jīng)有研究表明,支原體參與代謝的酶類如烯醇化酶（enolase）,甘油醛-3一磷酸脫氫酶（GAPDH）,丙酮酸激酶（pyruvate kinase, PK）,除了自身的催化功能外,還可以作為毒力因子參與致病的作用。目前在雞毒支原體中的的丙酮酸脫氫酶的功能尚不清楚... 

【文章來源】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：87 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
第—篇 文獻(xiàn)綜述
    第—章 丙酮酸脫氫酶研究進(jìn)展
        1.1 丙酮酸脫氫酶的概述
        1.2 丙酮酸脫氫酶的結(jié)構(gòu)
        1.3 丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的催化機(jī)理
        1.4 丙酮酸脫氫酶的功能
        1.5 研究雞毒支原體丙酮酸脫氫酶的意義
    第二章 支原體基因工程研究工具
        2.1 轉(zhuǎn)座子
        2.2 目的基因的敲除
        2.3 報告基因
        2.4 雞毒支原體隨機(jī)插入突變的研究意義
第二篇 丙酮酸脫氫酶的生物學(xué)功能研究
    第三章 丙酮酸脫氫酶E1和E2亞基的原核表達(dá)及多抗制備
        1 材料和方法
            1.1 菌種、載體、抗體及動物
            1.2 儀器
            1.3 試劑
            1.4 雞毒支原體Rlow株基因組的提取
            1.5 pdha和pdhb基因的overlap PCR擴(kuò)增
            1.6 重組表達(dá)載體的構(gòu)建
            1.7 目的基因的原核表達(dá)和蛋白純化
            1.8 多克隆抗體的制備及免疫原性的分析
        2 結(jié)果
            2.1 Overlap PCR擴(kuò)增目的基因
            2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化
            2.4 多抗的鑒定
        3 討論
    第四章 雞毒支原體丙酮酸脫氫酶的酶活性研究
        1 材料和方法
            1.1 儀器
            1.2 試劑
            1.3 二氯吲哚酚法測定丙酮酸脫氫酶活性
            1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定
            1.5 DCPIP的穩(wěn)定性
            1.6 His-PDHA和His-PDHB的相對比活性測定
            1.7 不同DCPIP濃度對反應(yīng)速率的影響
            1.8 pH對His-PDH活性影響
            1.9 溫度對His-PDH活性的影響
            1.10 金屬離子對His-PDH活性的影響
        2 結(jié)果
            2.1 DCPIP標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
            2.2 DCPIP穩(wěn)定性試驗
            2.3 His-PDH的比活力測定
            2.4 米氏常數(shù)的測定
            2.5 溫度對His-PDH酶活性的影響
            2.6 pH值對His-PDH的影響
            2.7 金屬離子對反應(yīng)的影響
        3 討論
    第五章 雞毒支原體丙酮酸脫氫酶E1和E2亞基的亞細(xì)胞定位及其生物學(xué)特性研究
        1 材料與方法
            1.1 菌株、細(xì)胞株和載體
            1.2 儀器
            1.3 試劑
            1.4 雞毒支原體膜蛋白的提取
            1.5 Western-blot試驗
            1.6 間接免疫熒光試驗
            1.7 纖連蛋白結(jié)合試驗
            1.8 配體結(jié)合試驗
            1.9 黏附及其黏附抑制試驗
            1.10 膜表面展示載體的構(gòu)建和表達(dá)
            1.11 重組菌對DF-1細(xì)胞的黏附和黏附抑制試驗
            1.12 多抗血清體外殺菌試驗
        2 結(jié)果
            2.1 Western-blot檢測
            2.2 懸浮法免疫熒光檢測
            2.3 纖連蛋白結(jié)合試驗
            2.4 配體結(jié)合試驗
            2.5 雞毒支原體黏附細(xì)胞及其黏附抑制試驗
            2.6 膜表面展示載體的構(gòu)建和表達(dá)
            2.7 PDHA和PDHB介導(dǎo)的大腸桿菌黏附DF1細(xì)胞
            2.8 His-PDHA和His-PDHB多抗血清的體外殺菌實驗
        3 討論
第三篇 隨機(jī)缺失轉(zhuǎn)座載體的構(gòu)建
    第六章 雞毒支原體隨機(jī)缺失轉(zhuǎn)座載體的構(gòu)建
        1 材料與方法
            1.1 菌株與載體
            1.2 儀器
            1.3 試劑
            1.4 藥敏試驗
            1.5 mini-Tn4001SpGm轉(zhuǎn)座子的構(gòu)建策略
            1.6 mini-Tn4001SpGm載體的構(gòu)建
            1.7 隨機(jī)轉(zhuǎn)座載體電轉(zhuǎn)化
            1.8 隨機(jī)突變株篩選方法
            1.9 突變株的Southern雜交鑒定
            1.10 插入位置的確認(rèn)
        2 結(jié)果
            2.1 藥敏試驗
            2.2 液體藥敏試驗
            2.3 隨機(jī)缺失轉(zhuǎn)座載體的構(gòu)建
            2.4 隨機(jī)缺失轉(zhuǎn)座載體的構(gòu)建
            2.5 重組子篩選鑒定結(jié)果
        4 討論
參考文獻(xiàn)
全文總結(jié)
致謝
攻讀碩士期間論文發(fā)表情況


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]丙酮酸脫氫酶E1α亞單位缺陷導(dǎo)致Leigh綜合征[J]. 張堯,孫芳,楊艷玲,常杏芝,戚豫,齊朝月,肖江喜,秦炯,吳希如.  中國當(dāng)代兒科雜志. 2007(03)



本文編號：3341915