豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）,是引起母豬繁殖障礙和仔豬出現(xiàn)呼吸道疾病的重要病原。該病毒感染后,能夠破壞免疫細(xì)胞,延遲宿主產(chǎn)生中和抗體和細(xì)胞免疫應(yīng)答,造成免疫抑制,對養(yǎng)豬業(yè)危害極大。粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）,是一種具有多項(xiàng)潛能的造血生長因子,能夠促進(jìn)樹突狀細(xì)胞分化和成熟,進(jìn)而增強(qiáng)其抗原遞呈能力。為提高我國目前現(xiàn)有高致病性PRRSV弱毒疫苗的免疫效果,本研究在高致病性PRRSV（HP-PRRSV）弱毒疫苗株HuN4-F112感染性分子克隆的基礎(chǔ)上,利用融合PCR的方法,將豬源GM-CSF基因序列,引入到弱毒疫苗株HuN4-F112基因組ORF1b和ORF2a之間,最終獲得了表達(dá)GM-CSF的重組PRRSV,并在體內(nèi)外進(jìn)行了重組病毒的生物學(xué)特性分析。在試驗(yàn)中,首先構(gòu)建了重組表達(dá)載體pHuN4-F112-GM-CSF;為確保GM-CSF基因在PRRSV中的遺傳穩(wěn)定性,我們在GM-CSF基因后插入PRRSV ORF6的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列（TRS6）,構(gòu)建了pHuN4-F... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：103 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略表
第一章 引言
    1.1 豬繁殖與呼吸綜合征
    1.2 豬繁殖與呼吸綜合征病毒
        1.2.1 病毒的結(jié)構(gòu)蛋白及其功能
        1.2.2 病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白及其功能
        1.2.3 病毒的細(xì)胞嗜性
    1.3 PRRSV的免疫應(yīng)答和持續(xù)性感染
        1.3.1 先天性免疫和病毒持續(xù)感染
        1.3.2 獲得性免疫
            1.3.2.1 體液免疫
            1.3.2.2 細(xì)胞免疫
    1.4 PRRSV疫苗
        1.4.1 現(xiàn)有疫苗及問題
        1.4.2 PRRSV新型疫苗
            1.4.2.1 細(xì)胞因子作為免疫佐劑
            1.4.2.2 化學(xué)試劑作為免疫佐劑
            1.4.2.3 細(xì)菌代謝產(chǎn)物
    1.5 粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的功能及應(yīng)用
        1.5.1 GM-CSF
        1.5.2 GM-CSF在T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)中的作用
        1.5.3 GM-CSF在抗腫瘤免疫中的作用
        1.5.4 GM-CSF作為疫苗佐劑的應(yīng)用
    1.6 研究目的及意義
第二章 表達(dá)豬源GM-CSF重組PRRS病毒的構(gòu)建
    摘要
    2.1 材料和方法
        2.1.1 病毒株、細(xì)胞和載體
        2.1.2 主要儀器
        2.1.3 含有GM-CSF重組PRRSV感染性分子克隆的構(gòu)建
        2.1.4 pSK-HuN4-F112-DEF-GM-CSF-TRS6和pSK-HuN4-F112-DEF-GM-CSF質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.1.4.1 引物設(shè)計(jì)
            2.1.4.2 利用融合PCR方法構(gòu)建重組質(zhì)粒的具體實(shí)施步驟
        2.1.5 含有GM-CSF的重組PRRSV的拯救
            2.1.5.1 重組PRRSV全長cDNA的構(gòu)建
            2.1.5.2 重組PRRSV全長cDNA的線性化
            2.1.5.3 重組PRRSV線性化cDNA的體外轉(zhuǎn)錄
            2.1.5.4 重組病毒基因組RNA轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞
            2.1.5.5 重組病毒的拯救和傳代
        2.1.6 含有GM-CSF的重組PRRSV的鑒定
            2.1.6.1 RT-PCR鑒定和DNA測序分析
            2.1.6.2 重組病毒分子標(biāo)記的鑒定
            2.1.6.3 間接免疫熒光(IFA)鑒定
            2.1.6.4 Western blotting鑒定
        2.1.7 含有GM-CSF的重組PRRSV的生物學(xué)特性分析
            2.1.7.1 TCID50測定
            2.1.7.2 病毒生長曲線繪制
            2.1.7.3 重組病毒噬斑形成的形態(tài)分析
            2.1.7.4 重組病毒的遺傳穩(wěn)定性分析
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 重組病毒的細(xì)胞病變觀察
        2.2.2 重組病毒的MluI酶切鑒定
        2.2.3 重組病毒的RT-PCR鑒定及測序分析
        2.2.4 重組病毒表達(dá)GM-CSF蛋白的IFA鑒定
        2.2.5 重組病毒表達(dá)pGM-CSF蛋白的Western blot鑒定
        2.2.6 重組病毒的生物學(xué)特性分析
            2.2.6.1 重組病毒的生長滴度測定
            2.2.6.2 重組病毒噬斑形態(tài)分析
            2.2.6.3 重組病毒的生長曲線的繪制
            2.2.6.4 重組病毒的遺傳穩(wěn)定性分析
    2.3 討論
第三章 表達(dá)豬源GM-CSF的缺失重組PRRS病毒的構(gòu)建
    摘要
    3.1 材料和方法
        3.1.1 病毒株、細(xì)胞和載體
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 含有GM-CSF的缺失重組PRRSV感染性分子克隆的構(gòu)建
        3.1.4 含有GM-CSF的缺失重組PRRSV的拯救
            3.1.4.1 缺失重組PRRSV全長cDNA的線性化
            3.1.4.2 缺失重組PRRSV全長線性化cDNA的體外轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)染
            3.1.4.3 缺失重組病毒的拯救和傳代
        3.1.5 含有GM-CSF的缺失重組病毒的鑒定分析
            3.1.5.1 RT-PCR和DNA測序鑒定
            3.1.5.2 缺失重組病毒分子標(biāo)記酶切鑒定
            3.1.5.3 間接免疫熒光(IFA)鑒定分析
        3.1.6 含有GM-CSF的缺失重組病毒生物學(xué)特性分析
            3.1.6.1 缺失重組病毒的生長滴度測定
            3.1.6.2 缺失重組病毒的生長曲線繪制
            3.1.6.3 缺失重組病毒空斑形成的形態(tài)分析
            3.1.6.4 缺失重組病毒的遺傳穩(wěn)定性分析
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 缺失重組質(zhì)粒全長的構(gòu)建
        3.2.2 缺失病毒的細(xì)胞病變觀察
        3.2.3 缺失病毒的分子標(biāo)記酶切鑒定
        3.2.4 RT-PCR鑒定和DNA測序分析
        3.2.5 缺失病毒表達(dá)pGM-CSF蛋白的IFA鑒定
        3.2.6 缺失病毒的生物學(xué)特性分析
            3.2.6.1 生長滴度測定
            3.2.6.2 病毒的生長動(dòng)力學(xué)分析
            3.2.6.3 病毒噬斑形態(tài)分析
            3.2.6.4 缺失病毒的遺傳穩(wěn)定性分析
    3.3 討論
第四章 重組病毒體外促進(jìn)骨髓源樹突狀細(xì)胞成熟和分化作用的研究
    摘要
    4.1 材料和方法
        4.1.1 病毒株和細(xì)胞
        4.1.2 主要儀器和試劑
        4.1.3 豬骨髓細(xì)胞(BMHC)分離
        4.1.4 豬骨髓源樹突狀細(xì)胞(BMDC)的培養(yǎng)
        4.1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面分子表達(dá)
        4.1.6 細(xì)胞因子檢測
        4.1.7 細(xì)胞因子mRNA水平檢測
            4.1.7.1 相對熒光定量PCR引物的設(shè)計(jì)
            4.1.7.2 提取細(xì)胞總RNA
            4.1.7.3 合成cDNA
            4.1.7.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
    4.2 結(jié)果
        4.2.1 表達(dá)GM-CSF的重組PRRSV對GM-CSF蛋白預(yù)刺激的BMHC的作用
        4.2.2 表達(dá)GM-CSF的重組PRRSV直接對BMHC的刺激作用
        4.2.3 細(xì)胞因子檢測
        4.2.4 細(xì)胞因子mRNA水平檢測
    4.3 討論
第五章 重組病毒感染豬誘導(dǎo)的免疫特性分析
    摘要
    5.1 材料與方法
        5.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        5.1.2 細(xì)胞、病毒和病毒擴(kuò)增
        5.1.3 主要儀器
        5.1.4 實(shí)驗(yàn)分組及免疫劑量
        5.1.5 血清中PRRSV抗體水平檢測
        5.1.6 血清中病毒含量的測定
        5.1.7 流式術(shù)檢測免疫細(xì)胞的活化水平
    5.2 結(jié)果
        5.2.1 重組病毒免疫豬后的體溫變化及臨床觀察
        5.2.2 豬血清中PRRSV抗體檢測結(jié)果
        5.2.3 豬血清中病毒含量的檢測結(jié)果
        5.2.4 流式術(shù)分析外周血免疫細(xì)胞的變化
        5.2.5 組織病理學(xué)檢測結(jié)果
    5.3 討論
第六章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡歷


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]豬繁殖與呼吸綜合征病毒Taq Man-MGB熒光定量RT-PCR方法的建立和應(yīng)用[J]. 韋天超,田志軍,安同慶,周艷君,肖燕,姜一峰,郝曉芳,張善瑞,彭金美,仇華吉,童光志.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2008(12)
[2]高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離鑒定及其分子流行病學(xué)分析[J]. 童光志,周艷君,郝曉芳,田志軍,仇華吉,彭金美,安同慶.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2007(05)
[3]從疑似PRRS流產(chǎn)胎兒分離PRRSV的研究[J]. 郭寶清,陳章水,劉文興,崔益洙.  中國畜禽傳染病. 1996(02)

博士論文
[1]高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒致弱毒株NSP2復(fù)制非必需區(qū)的鑒定及其表達(dá)外源基因的研究[D]. 徐彥召.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2012
[2]表達(dá)免疫刺激因子的重組狂犬疫苗對狂犬病的暴露前及暴露后預(yù)防研究[D]. 王化磊.吉林大學(xué) 2010



本文編號：3333450