近年來,大量的研究表明miRNA在脂肪細胞分化和脂質代謝方面起著重要的調控作用,miRNA通過靶向脂肪生成的重要轉錄因子和脂質代謝關鍵基因調控脂肪細胞分化和脂質代謝。本論文基于5月齡大白豬和梅山豬的背部脂肪組織Solexa測序獲得的差異表達的miRNAs,通過對miRNAs的序列分析、靶基因預測和功能分析等,靶定miR-224、miR-146b、miR-215和miR-135a。采用雙熒素酶報告基因檢測、Q-PCR、Western blotting等方法對4個miRNAs的作用和功能進行了研究,主要研究結果如下：1. miR-224調控脂肪細胞分化和脂肪酸代謝經(jīng)UCSC網(wǎng)站比對發(fā)現(xiàn),包括豬在內的多種哺乳動物的miR-224定位在X染色體上的相同的位置,即GABRE基因的內含子處；通過對miR-224的前體序列和成熟序列進行比對,它們在哺乳動物中的序列高度保守。通過多種靶基因預測軟件預測發(fā)現(xiàn),EGR2和ACSL4可能是miR-224的靶基因。雙熒光素酶報告試驗證實,與對照組相比, miR-224-5p明顯抑制了EGR2-3’UTR和ACSL4-3’UTR雙熒光素酶報告載體的熒光活性。在3... 

【文章來源】：華中農業(yè)大學湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：135 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
中英文縮寫對照表
第一章 文獻綜述
    1 引言
    2 脂肪生成概述
        2.1 脂肪生成過程
        2.2 調控脂肪生成的重要轉錄因子
            2.2.1 PPAR家族
            2.2.2 C/EBPs家族
        2.3 TGFβ信號通路與脂肪生成
        2.4 Wnt信號通路與脂肪生成
    3 脂質代謝
        3.1 脂肪酸的β-氧化
            3.1.1 脂肪酸的活化
            3.1.2 脂酰CoA進入線粒體
            3.1.3 脂肪酸的β-氧化
        3.2 脂肪酸碳鏈的延長
    4 miRNA調控脂肪細胞分化和脂質代謝
        4.1 miRNA的生物合成和作用機制
        4.2 miRNA主要檢測方法
            4.2.1 傳統(tǒng)的克隆方法
            4.2.2 Northern blotting雜交
            4.2.3 miRNA芯片
            4.2.4 Q-PCR(real time quantitative PCR)
            4.2.5 高通量測序
        4.3 miRNA調控脂肪細胞分化
            4.3.1 miRNA促進脂肪細胞分化
            4.3.2 miRNA抑制脂肪細胞分化
        4.4 miRNA調控脂質代謝
    5 問題的提出及課題的目的與意義
第二章 miR-224對脂肪細胞分化和脂肪酸代謝的作用研究
    1 材料與方法
        1.1 載體和菌株
        1.2 主要試劑和儀器
        1.3 主要溶液的配制
        1.4 細胞培養(yǎng)及誘導分化
            1.4.1. 細胞的復蘇
            1.4.2 細胞的常規(guī)培養(yǎng)
            1.4.3 細胞凍存
            1.4.4 3T3-L1細胞的誘導分化
        1.5 細胞轉染及雙熒光素酶活性的測定
            1.5.1 細胞的轉染
            1.5.2 熒光素酶相對活性的檢測
        1.6 細胞總RNA的提取
        1.7 Q-PCR分析
            1.7.1 miRNA的定量分析
            1.7.2 基因的定量分析
        1.8 油紅O染色
        1.9 甘油三酯和游離脂肪酸含量測定
        1.10 靶基因預測以及預測靶基因3'UTR雙熒光素酶報告載體及其突變載體的構建
            1.10.1 靶基因預測
            1.10.2 預測靶基因3'UTR雙熒光素酶報告載體及其突變載體的構建
        1.11 靶基因的鑒定
        1.12 Western blotting分析
            1.12.1 蛋白提取
            1.12.2 SDS-PAGE電泳
            1.12.3 轉膜
            1.12.4 抗原抗體免疫反應
            1.12.5 抗體
        1.13 主要數(shù)據(jù)庫及分析軟件
        1.14 統(tǒng)計學分析
    2 結果與分析
        2.1 miR-224序列保守性分析
        2.2 miR-224-5p的表達譜分析
        2.3 miR-224-5p抑制小鼠3T3-L1前脂肪細胞的分化
        2.4 miR-224靶基因的鑒定
        2.5 miR-224-5p在脂肪細胞分化早期抑制脂肪細胞的分化
        2.6 miR-224-5p調節(jié)脂肪酸代謝
        2.7 討論
            2.7.1 miR-224的序列分析和表達譜分析
            2.7.2 miR-224調控脂肪細胞分化
            2.7.3 miR-224調控脂肪酸代謝
第三章 miR-146b在脂肪細胞分化過程中的作用研究
    1 材料與方法
    2 結果與分析
        2.1 miR-146b序列保守性分析
        2.2 miR-146b-5p的表達譜分析
        2.3 miR-146b-5p促進3T3-L1前脂肪細胞的分化
        2.4 miR-146b靶基因的鑒定
        2.5 miR-146-5p通過靶向Runx1t1和Smad4促進脂肪細胞的分化
        2.6 討論
            2.6.1 miR-146b的序列分析
            2.6.2 miR-146b調控脂肪細胞分化
第四章 miR-215在脂肪細胞分化過程中的作用研究
    1 材料與方法
    2 結果與分析
        2.1 miR-215序列保守性分析
        2.2 miR-215-5p抑制3T3-L1前脂肪細胞的分化
        2.3 miR-215靶基因的鑒定
        2.4 miR-215-5p通過靶向FNDC3B和CTNNBIP1抑制脂肪細胞的分化
        2.5 討論
            2.5.1 miR-215的序列分析
            2.5.2 miR-215調控脂肪細胞分化
第五章 miR-135a調控脂肪酸碳鏈的延長
    1 材料與方法
    2 結果與分析
        2.1 miR-135a序列保守性分析
        2.2 miR-135a靶基因的鑒定
        2.3 討論
第六章 討論
    1 miRNA的保守性
    2 miRNA靶基因預測
    3 miRNA調控脂肪生成和脂質代謝
    4 主要創(chuàng)新點
    5 不足之處
    6 下一步工作計劃
參考文獻
附錄Ⅰ
研究生在讀期間發(fā)表的主要論文
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]動物中microRNA的保守性和進化歷程[J]. 羅艷,張群,梁宇君,張士璀.  中國科學:生命科學. 2012(02)
[2]編碼極長鏈脂肪酸延長酶基因家族的結構及其產物的功能[J]. 王海燕,蘇玉虹.  生命的化學. 2005(01)



本文編號：3333238