近年來,大量的研究表明miRNA在脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)代謝方面起著重要的調(diào)控作用,miRNA通過靶向脂肪生成的重要轉(zhuǎn)錄因子和脂質(zhì)代謝關(guān)鍵基因調(diào)控脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)代謝。本論文基于5月齡大白豬和梅山豬的背部脂肪組織Solexa測(cè)序獲得的差異表達(dá)的miRNAs,通過對(duì)miRNAs的序列分析、靶基因預(yù)測(cè)和功能分析等,靶定miR-224、miR-146b、miR-215和miR-135a。采用雙熒素酶報(bào)告基因檢測(cè)、Q-PCR、Western blotting等方法對(duì)4個(gè)miRNAs的作用和功能進(jìn)行了研究,主要研究結(jié)果如下：1. miR-224調(diào)控脂肪細(xì)胞分化和脂肪酸代謝經(jīng)UCSC網(wǎng)站比對(duì)發(fā)現(xiàn),包括豬在內(nèi)的多種哺乳動(dòng)物的miR-224定位在X染色體上的相同的位置,即GABRE基因的內(nèi)含子處；通過對(duì)miR-224的前體序列和成熟序列進(jìn)行比對(duì),它們?cè)诓溉閯?dòng)物中的序列高度保守。通過多種靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),EGR2和ACSL4可能是miR-224的靶基因。雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)證實(shí),與對(duì)照組相比, miR-224-5p明顯抑制了EGR2-3’UTR和ACSL4-3’UTR雙熒光素酶報(bào)告載體的熒光活性。在3... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：135 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
中英文縮寫對(duì)照表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 引言
    2 脂肪生成概述
        2.1 脂肪生成過程
        2.2 調(diào)控脂肪生成的重要轉(zhuǎn)錄因子
            2.2.1 PPAR家族
            2.2.2 C/EBPs家族
        2.3 TGFβ信號(hào)通路與脂肪生成
        2.4 Wnt信號(hào)通路與脂肪生成
    3 脂質(zhì)代謝
        3.1 脂肪酸的β-氧化
            3.1.1 脂肪酸的活化
            3.1.2 脂酰CoA進(jìn)入線粒體
            3.1.3 脂肪酸的β-氧化
        3.2 脂肪酸碳鏈的延長
    4 miRNA調(diào)控脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)代謝
        4.1 miRNA的生物合成和作用機(jī)制
        4.2 miRNA主要檢測(cè)方法
            4.2.1 傳統(tǒng)的克隆方法
            4.2.2 Northern blotting雜交
            4.2.3 miRNA芯片
            4.2.4 Q-PCR(real time quantitative PCR)
            4.2.5 高通量測(cè)序
        4.3 miRNA調(diào)控脂肪細(xì)胞分化
            4.3.1 miRNA促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化
            4.3.2 miRNA抑制脂肪細(xì)胞分化
        4.4 miRNA調(diào)控脂質(zhì)代謝
    5 問題的提出及課題的目的與意義
第二章 miR-224對(duì)脂肪細(xì)胞分化和脂肪酸代謝的作用研究
    1 材料與方法
        1.1 載體和菌株
        1.2 主要試劑和儀器
        1.3 主要溶液的配制
        1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化
            1.4.1. 細(xì)胞的復(fù)蘇
            1.4.2 細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)
            1.4.3 細(xì)胞凍存
            1.4.4 3T3-L1細(xì)胞的誘導(dǎo)分化
        1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及雙熒光素酶活性的測(cè)定
            1.5.1 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染
            1.5.2 熒光素酶相對(duì)活性的檢測(cè)
        1.6 細(xì)胞總RNA的提取
        1.7 Q-PCR分析
            1.7.1 miRNA的定量分析
            1.7.2 基因的定量分析
        1.8 油紅O染色
        1.9 甘油三酯和游離脂肪酸含量測(cè)定
        1.10 靶基因預(yù)測(cè)以及預(yù)測(cè)靶基因3'UTR雙熒光素酶報(bào)告載體及其突變載體的構(gòu)建
            1.10.1 靶基因預(yù)測(cè)
            1.10.2 預(yù)測(cè)靶基因3'UTR雙熒光素酶報(bào)告載體及其突變載體的構(gòu)建
        1.11 靶基因的鑒定
        1.12 Western blotting分析
            1.12.1 蛋白提取
            1.12.2 SDS-PAGE電泳
            1.12.3 轉(zhuǎn)膜
            1.12.4 抗原抗體免疫反應(yīng)
            1.12.5 抗體
        1.13 主要數(shù)據(jù)庫及分析軟件
        1.14 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 miR-224序列保守性分析
        2.2 miR-224-5p的表達(dá)譜分析
        2.3 miR-224-5p抑制小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化
        2.4 miR-224靶基因的鑒定
        2.5 miR-224-5p在脂肪細(xì)胞分化早期抑制脂肪細(xì)胞的分化
        2.6 miR-224-5p調(diào)節(jié)脂肪酸代謝
        2.7 討論
            2.7.1 miR-224的序列分析和表達(dá)譜分析
            2.7.2 miR-224調(diào)控脂肪細(xì)胞分化
            2.7.3 miR-224調(diào)控脂肪酸代謝
第三章 miR-146b在脂肪細(xì)胞分化過程中的作用研究
    1 材料與方法
    2 結(jié)果與分析
        2.1 miR-146b序列保守性分析
        2.2 miR-146b-5p的表達(dá)譜分析
        2.3 miR-146b-5p促進(jìn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化
        2.4 miR-146b靶基因的鑒定
        2.5 miR-146-5p通過靶向Runx1t1和Smad4促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化
        2.6 討論
            2.6.1 miR-146b的序列分析
            2.6.2 miR-146b調(diào)控脂肪細(xì)胞分化
第四章 miR-215在脂肪細(xì)胞分化過程中的作用研究
    1 材料與方法
    2 結(jié)果與分析
        2.1 miR-215序列保守性分析
        2.2 miR-215-5p抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化
        2.3 miR-215靶基因的鑒定
        2.4 miR-215-5p通過靶向FNDC3B和CTNNBIP1抑制脂肪細(xì)胞的分化
        2.5 討論
            2.5.1 miR-215的序列分析
            2.5.2 miR-215調(diào)控脂肪細(xì)胞分化
第五章 miR-135a調(diào)控脂肪酸碳鏈的延長
    1 材料與方法
    2 結(jié)果與分析
        2.1 miR-135a序列保守性分析
        2.2 miR-135a靶基因的鑒定
        2.3 討論
第六章 討論
    1 miRNA的保守性
    2 miRNA靶基因預(yù)測(cè)
    3 miRNA調(diào)控脂肪生成和脂質(zhì)代謝
    4 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)
    5 不足之處
    6 下一步工作計(jì)劃
參考文獻(xiàn)
附錄Ⅰ
研究生在讀期間發(fā)表的主要論文
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]動(dòng)物中microRNA的保守性和進(jìn)化歷程[J]. 羅艷,張群,梁宇君,張士璀.  中國科學(xué):生命科學(xué). 2012(02)
[2]編碼極長鏈脂肪酸延長酶基因家族的結(jié)構(gòu)及其產(chǎn)物的功能[J]. 王海燕,蘇玉虹.  生命的化學(xué). 2005(01)



本文編號(hào)：3333238