發(fā)布時(shí)間：2021-08-09 11:24

　　豬傳染性胸膜肺炎（Porcine Contagious Pleuropneumonia, PCP）是由胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae, APP）引起豬的一種高度接觸性傳染病,該病嚴(yán)重危害世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展,給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究就其分離鑒定與血清7型菌株體內(nèi)誘導(dǎo)基因篩選作了以下工作：1.APP的分離鑒定本研究從四川某豬場(chǎng)的疑似豬傳染性胸膜肺炎的病豬中分離到一株革蘭氏陰性短桿菌。經(jīng)染色鏡檢、生化試驗(yàn)、PCR檢測(cè)、血清型檢測(cè)和藥敏試驗(yàn)等鑒定,結(jié)果表明分離株的生化試驗(yàn)結(jié)果與多數(shù)APP分離株的一致,采用PCR可擴(kuò)增出約450bp左右的APP特異性目的條帶,利用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)對(duì)分離株進(jìn)行血清型鑒定為7型,藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示該分離株對(duì)大多數(shù)藥物都比較敏感,僅對(duì)林可霉素耐藥。綜合判定該分離株為豬APP的7型菌株。2.APP7基因組表達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建本研究用pET28a/b/c載體構(gòu)建表達(dá)文庫(kù)。提取APP血清7型的基因組DNA,經(jīng)Sau3A I經(jīng)行不完全酶切,回收0.5～2kb的DNA片段。純化后的DNA片段與經(jīng)具有相同酶切位點(diǎn)的BamHI單酶切及C... 

【文章來(lái)源】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)四川省 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：71 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
符號(hào)說(shuō)明
第一部分 文獻(xiàn)綜述
    1 胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌概述
        1.1 胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌的病原學(xué)
        1.2 胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌主要毒力因子研究進(jìn)展
            1.2.1 Apx毒素
            1.2.2 其他毒力因子
        1.3 病原的分離鑒定及診斷
        1.4 豬傳染性胸膜肺炎疫苗的研究進(jìn)展
    2 體內(nèi)誘導(dǎo)抗原技術(shù)(IVIAT)簡(jiǎn)介
        2.1 IVIAT的基本原理與實(shí)驗(yàn)流程
            2.1.1 血清的收集與處理
            2.1.2 構(gòu)建基因組文庫(kù)
            2.1.3 體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)基因的篩選
        2.2 IVIAT的應(yīng)用
            2.2.1 IVIAT技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)
    3 研究的目的及意義
第二部分 研究部分
    第一章 胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌的分離與鑒定
        1. 材料
            1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株和血清
            1.2 主要試劑和培養(yǎng)基
            1.3 分離病料
            1.4 主要儀器
        2 方法
            2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)
            2.2 分離菌的病原特性觀察
            2.3 分離菌的生化試驗(yàn)鑒定
            2.4 分離菌的PCR鑒定
            2.5 細(xì)菌血清型鑒定
            2.6 細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)
        3 結(jié)果
            3.1 細(xì)菌分離結(jié)果
            3.2 細(xì)菌培養(yǎng)特性
            3.3 細(xì)菌的生化特點(diǎn)
            3.4 細(xì)菌的PCR鑒定結(jié)果
            3.5 細(xì)菌的血清實(shí)驗(yàn)結(jié)果
            3.6 細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果
        4. 討論
            4.1 胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌的分離
            4.2 APP的鑒定
            4.3 血清分型與藥敏試驗(yàn)
            4.4 APP分離鑒定的意義
    第二章 APP血清7型菌株基因表達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建
        1. 材料
            1.1 菌株與質(zhì)粒
            1.2 主要試劑
        2 方法
            2.1 APP血清7型菌株的活化
            2.2 APP7型菌株基因組提取
            2.3 APP7基因組酶切
                2.3.1 APP基因組酶切的酶量?jī)?yōu)化
                2.3.2 APP基因組DNA片段的回收
            2.4 構(gòu)建文庫(kù)使用載體的制備
                2.4.1 質(zhì)粒pET28 a/b/c提取
                2.4.2 質(zhì)粒pET28 a/b/c的BamHI的酶切及去磷酸化
            2.5 DH5a電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備
            2.6 酶切片段與載體連接
                2.6.1 酶切片段與載體連接體系的優(yōu)化
                2.6.2 連接
                2.6.3 連接產(chǎn)物的電轉(zhuǎn)化
            2.7 再轉(zhuǎn)化
            2.8 表達(dá)文庫(kù)的PCR鑒定
                2.8.1 pET28系列通用引物設(shè)計(jì)
                2.8.2 重組質(zhì)粒的PCR鑒定及插入率估算
            2.9 表達(dá)文庫(kù)的酶切鑒定
        3 結(jié)果
            3.1 APP7基因組酶切優(yōu)化結(jié)果
            3.2 APP7基因組酶大量酶切結(jié)果
            3.3 質(zhì)粒pET28 a/b/c的提取與單酶切去磷酸化結(jié)果
            3.4 連接體系優(yōu)化結(jié)果
            3.5 基因表達(dá)文庫(kù)的PCR鑒定結(jié)果
            3.6 基因表達(dá)文庫(kù)的雙酶切鑒定結(jié)果
        4 討論
            4.1 基因組的提取與部分酶切
            4.2 質(zhì)粒pET28-a/b/c質(zhì)粒的處理
            4.3 基因組與表達(dá)載體的連接
            4.4 文庫(kù)的構(gòu)建
    第三章 胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌體內(nèi)誘導(dǎo)抗原基因的篩選
        1 材料
            1.1 菌株、血清及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            1.2 主要試劑
            1.3 主要儀器設(shè)備
        2 方法
            2.1 康復(fù)血清的制備及效價(jià)測(cè)定
            2.2 血清吸附
                2.2.1 全細(xì)胞吸附
                2.2.2 細(xì)胞裂解物及熱變性裂解物吸附
                2.2.3 血清的吸附效果檢測(cè)
            2.3 基因組文庫(kù)的篩選
        3 結(jié)果
            3.1 康復(fù)血清的制備結(jié)果
            3.2 康復(fù)血清的吸附效果
            3.3 APP血清7型體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)抗原的篩選
            3.4 陽(yáng)性克隆測(cè)序結(jié)果
        4 討論
            4.1 IVIAT在胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌上的應(yīng)用
            4.2 FTs A基因
            4.3 Fts K基因
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
附錄


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J]. 洪波,任曉金,金訪(fǎng)中,李永明.  中國(guó)畜牧獸醫(yī)文摘. 2013(11)
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[4]3株豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌山東株的分離及鑒定[J]. 苗立中,李峰,吳憶春,王艷,林初文,沈志強(qiáng).  中國(guó)畜牧獸醫(yī). 2010(08)
[5]副豬嗜血桿菌部分體內(nèi)誘導(dǎo)基因的篩選[J]. 都啟晶,曹三杰,王國(guó)鑌,唐彬川,張芯銓,黃小波,文心田.  中國(guó)獸醫(yī)科學(xué). 2010(07)
[6]規(guī)模化豬場(chǎng)傳染性胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌的分離鑒定[J]. 徐引弟,王治方,朱文豪,梁躍,郭成留.  畜牧與獸醫(yī). 2010(07)
[7]豬傳染性胸膜肺炎病原學(xué)研究進(jìn)展[J]. 梁望旺,伍銳,楊克禮,熊忠良,劉澤文,徐滌平.  安徽農(nóng)業(yè)科學(xué). 2008(13)
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[9]豬傳染性胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌毒素I基因的克隆、序列分析及表達(dá)[J]. 王芳,何孔旺,邱索平,彭小華,倪艷秀,張雪寒,郭容利,俞正玉.  中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2006(02)
[10]豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌血清1型RTX毒素I的N-端表達(dá)多肽具有良好的免疫原性[J]. 梅嶺,周銳,盧海松,貝為成,劉維紅,林荔雯,洪文洲,陳煥春.  生物工程學(xué)報(bào). 2006(01)

博士論文
[1]豬傳染性胃腸炎檢測(cè)基因芯片與豬傳染性胃腸炎病毒SC-H株N基因表達(dá)研究[D]. 黃小波.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2006

碩士論文
[1]中國(guó)豬鏈球菌2型強(qiáng)致病株體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)基因的篩選研究[D]. 宋潔.第三軍醫(yī)大學(xué) 2011
[2]胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌體內(nèi)誘導(dǎo)抗原的篩選與鑒定[D]. 師麗敏.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2010
[3]應(yīng)用體內(nèi)誘導(dǎo)抗原技術(shù)篩選仔豬大腸桿菌0139體內(nèi)表達(dá)基因的初步研究[D]. 劉付敏.西南大學(xué) 2009
[4]淄博地區(qū)豬傳染性胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌的分離鑒定及免疫預(yù)防研究[D]. 陳凱.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2007



本文編號(hào)：3331979